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目的从保护肝脏线粒体和调控内源性抗氧化酶系统两个角度,选用急性酒精性肝损伤大鼠、刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤小鼠两种常用实验性肝损伤动物模型以及乙醇损伤人胚肝细胞L-02模型,观察、评价溪黄草总二萜的保肝作用,指出其可能的作用靶点,为溪黄草的合理应用提供客观参考。方法1.以不同浓度种板测定L-02细胞生长曲线;以不同终浓度的乙醇工作液作用正常细胞4h,MTT法测定细胞活力,筛选合适造模浓度;以不同终浓度的溪黄草总二萜作用正常细胞12h,MTT法测定细胞活力,推算IC50值;以终浓度为3%的乙醇工作液作用正常细胞4 h后,使用终浓度分别为5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL的溪黄草总二萜工作液作用12 h,检测培养上清转氨酶水平。2.SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、水飞蓟素组(46.7 mg/kg/d)、溪黄草总二萜高、中、低剂量组(100.0,50.0,25.0 mg/kg/d)。除正常对照组,其余各组动物按10 mL/kg的灌胃体积,每天上午灌胃55%乙醇,每天1次,连续10 d,复制急性酒精性肝损伤模型。上午造模后禁食4 h,每天下午灌胃给药,每天1次,连续10 d。末次给药12h后,各组动物腹主动脉取血,分离血清检测转氨酶水平;将脾脏、胸腺和肝脏三个脏器完整切离,脾脏和胸腺于-80℃保存;HE染色对肝组织进行病理学观察;提取肝脏线粒体,检测线粒体膜电位(ΔΨm)、Ca2+诱导的MPTP开放程度,线粒体内 Mn-SOD 活力、8-OHdG 水平,Complex Ⅰ、Complex Ⅲ活性。制备 10%的肝匀浆测定MDA水平,GSH和GSH-Px活力;RT-PCR检测肝组织中Nrf2、Bach1、HO-1mRNA表达水平;Western Blot检测肝组织中Nrf2、Bach1在胞核的蛋白表达水平以及HO-1总蛋白的表达水平。3.KM小鼠随机分为正常对照组、模型组、水飞蓟素组(46.7 mg//kg/d)、溪黄草总二萜高、中、低剂量组(100.0,50.0,25.0 mg/kg/d)。各组按20 mL/kg的灌胃体积,每天灌胃给药,每天1次,连续7 d。末次给药后12 h,除正常对照组外,各组动物尾静脉注射刀豆蛋白A(Con A)(25 mg/kg/只),复制免疫性肝损伤模型。尾静脉注射ConA4h后,摘除眼球取血,分离血清检测转氨酶水平;将脾脏、胸腺和肝脏三个脏器完整切离,脾脏和胸腺于-80℃保存;HE染色对肝组织进行病理学观察;提取肝脏线粒体,检测线粒体膜电位(ΔΨm),线粒体内Mn-SOD活力、8-OHdG水平。制备10%的肝匀浆测定MDA水平,GSH和GSH-Px活力。4.利用皮尔逊相关系数,对酒精性肝损伤大鼠中肝脏线粒体和“Nrf2/Bach1-ARE-抗氧化酶”通路的各指标之间进行相关性分析,寻找溪黄草总二萜发挥作用的潜在位点。成果1.终浓度为2-15%(v/v)的乙醇作用于L-02肝细胞,细胞存活率明显下降(P<0.01)。浓度为7.81-62.50 μg/mL的溪黄草总二萜对正常细胞生长增殖无明显影响,溪黄草总二萜对正常L-02细胞的IC50值为138.10μg/mL。以终浓度为3%的乙醇作用于L-02细胞,培养上清ALT水平有所上升,AST水平则明显增加(P<0.01)。不同浓度溪黄草总二萜分别作用于损伤细胞后,均可降低肝细胞转氨酶的泄漏量,与模型组比较差异没有统计学意义。2.采用55%乙醇灌胃SD大鼠10d,成功诱导急性酒精性肝损伤。模型组肝细胞水肿,血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01或P<0.05);肝脏线粒体膜电位明显下降(P<0.05),MPTP开放程度明显增加(P<0.05);肝脏线粒体内Mn-SOD活力明显下降(P<0.01),8-OHdG水平明显升高(P<0.01);肝脏线粒体Complex Ⅰ、Complex Ⅲ活性明显下降(P<0.01)。经溪黄草总二萜治疗后,肝细胞水肿有所减轻,各治疗组血清ALT、AST水平均明显下降(P<0.01或P<0.05);总二萜低剂量组肝脏线粒体膜电位明显上升(P<0.05),总二萜中剂量组MPTP开放被明显抑制(P<0.05);总二萜低剂量组肝脏线粒体内Mn-SOD活力明显上升(P<0.05),总二萜各剂量组8-OHdG水平均明显下降(P<0.01):总二萜各剂量组肝脏线粒体Complex Ⅰ、ComplexⅢ活性均明显提高(P<0.01或P<0.05)。经相关性分析发现,肝脏线粒体内Mn-SOD活力可作为反映酒精性肝损伤大鼠肝功能状态的标志,而血清AST水平的测定有助于了解酒精性肝损伤大鼠肝脏线粒体损伤的程度或状态。3.尾静脉注射ConA,成功复制免疫性肝损伤小鼠模型。模型组肝细胞水肿,血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01或P<0.05);肝脏线粒体膜电位明显下降(P<0.05);肝脏线粒体内Mn-SOD活力明显下降(P<0.01),8-OHdG水平明显升高(P<0.01)。预防性给予溪黄草总二萜后,肝细胞水肿有所减轻,各治疗组血清ALT、AST水平均明显下降(P<0.01或P<0.05);总二萜高剂量组、中剂量组肝脏线粒体膜电位有所上升,差异无统计学意义;总二萜高剂量组肝脏线粒体内Mn-SOD活力明显上升(P<0.05),总二萜中剂量组8-OHdG水平均明显下降(P<0.01)。经相关性分析发现,肝脏线粒体内Mn-SOD活力可作为反映免疫性肝损伤小鼠肝功能状态的标志,而血清AST水平的测定有助于了解免疫性肝损伤小鼠肝脏线粒体损伤的程度或状态。4.急性酒精性肝损伤大鼠中模型组的肝匀浆内MDA水平明显升高(P<0.01),GSH、GSH-Px 活力明显下降(P<0.01 或 P<0.05);肝组织 Nrf2、Bach1、HO-1 mRNA表达均明显上升(P<0.01或P<0.05);总HO-1蛋白表达明显上升。经溪黄草总二萜治疗后,总二萜各剂量组MDA水平均明显下降(P<0.05),高剂量组GSH活力有明显增加(P<0.01),总二萜各剂量组GSH-Px活力均明显升高(P<0.01或P<0.05),总二萜中剂量组、高剂量组HO-1 mRNA、总蛋白表达明显上升(P<0.01或P<0.05)。5.免疫性肝损伤小鼠中,模型组的肝匀浆内MDA水平明显升高(P<0.01),GSH、GSH-Px活力明显下降(P<0.01);预防性给予溪黄草总二萜后,总二萜各剂量组MDA水平均明显下降(P<0.01),总二萜高剂量组、中剂量组GSH活力明显增加(P<0.01或P<0.05),总二萜高剂量组、低剂量组GSH-Px活力明显增加(P<0.05)。6.相关性分析显示,肝损伤发生后,Nrf2 mRNA与呼吸链复合物Ⅰ活性呈显著正相关(r=0.997,P<0.05)。经溪黄草总二萜治疗后,HO-1 mRNA与线粒体膜电位呈高度负相关(r=-0.878,P<0.01),总HO-1蛋白与MPTPΔA540值呈高度负相关(r=-0.806,P<0.01)。结论1.溪黄草总二萜可对抗乙醇损伤L-02细胞引起的ALT、AST泄漏,降低肝损伤动物模型血清中转氨酶活性、减轻肝细胞水肿,具有一定的保肝作用。2.溪黄草总二萜的保肝作用与保护肝脏线粒体有关,表现为保护线粒体膜完整性、提高线粒体抗氧化能力、减轻线粒体DNA氧化损伤、恢复线粒体氧化磷酸化系统。3.溪黄草总二萜的保肝作用与调控肝脏内源性抗氧化系统有关,表现为减轻脂质过氧化反应、提高抗氧化酶活力、HO-1的mRNA和总蛋白表达水平上升。4.溪黄草总二萜对肝脏线粒体的保护作用与HO-1的基因和蛋白表达的上调作用有关。