梨起源于中国西部和西南部的山区,改革开放以来,我国的梨产业得到了迅猛的发展,已经成为世界上第一产梨大国。然而,梨的生长发育受非生物胁迫的影响很大,其中尤以干旱胁迫造成的危害最为突出。如何培育出抗旱新品种成为育种学家亟待解决的问题,而基因工程的飞速发展为解决这一问题提供了新的思路。抗逆基因的筛选是基因工程的前提,研究表明MYB包含着一个大的转录因子家族,在植物生长发育和逆境胁迫中发挥重要作用,而目前对于MYB转录因子的功能以及其调控基因的了解甚少。前期经过杜梨干旱转录组数据分析,获得对干旱响应强烈的MYB转录因子(Pbr028812.1),同源性分析表明该基因与MdMYB21基因有高度的序列同源性,故命名为PbrMYB21。文献中鲜有对该基因的报道。本文以杜梨(Pyrus betuLaefolia)为试验材料,在梨中克隆得到一个新的的逆境响应基因PbrMYB21基因、验证其抗逆功能并探究其抗旱机理,主要结果如下:1、PbrMYB21属于R2R3类型的MYB转录因子,PbrMYB21是有完整的ORF区(开放式阅读框)的完整序列,ORF编码了 296个氨基酸残基、分子量33.2 KDa,等电点5.98。进化分析表明PbrMYB21与MdMYB21有82%的序列同源性。PbrMYB21亚细胞定位于细胞核并且具有转录激活活性。在各种非生物胁迫下尤其是脱水胁迫下PbrMYB21表达量增加。2、构建PbrMYB21超表达载体和基因沉默载体,通过超表达载体将基因稳定转化到烟草、用注射法将基因沉默载体瞬时转化到30天苗龄的杜梨中。PbrMYB21过表达烟草能提高其在脱水和干旱条件下的抗性,PbrMYB21基因沉默杜梨对干旱和脱水敏感。脱水和干旱后,转基因烟草比野生型有更高的成活率、更低的电导率含量、更低的丙二醛含量、更高的叶绿素含量、更低的H2O2和O2-的积累。在干旱处理前后转基因烟草比野生型烟草有更高的抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)、更高的干旱响应基因的表达量尤其是ADC含量(精氨酸脱羧酶)、更高的多胺含量。在梨中通过VIGS技术使该基因沉默,其在干旱条件下抗性减弱。在脱水和干旱处理后,基因沉默的杜梨比野生型有更低的成活率、更高的电导率含量、更高的丙二醛含量、更高的叶绿素含量、更高的H2O2和O2-的积累。在干旱处理前后,基因沉默杜梨有更低的抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)、更低的干旱响应基因的表达量尤其是ADC含量(精氨酸脱羧酶)、更低的多胺含量。3、PbrMYB21过表达烟草中ADC的表达量上升而PbrMYB21基因沉默杜梨中ADC的表达量下降,这意味着ADC基因可能是受PbrMYB21基因调控。使用酵母单杂交技术验证基因互作,结果表明PbrMYB21在酵母中与PbrADC的启动子互作。为进一步验证酵母单杂结果,用双荧光素酶技术进行转录表达分析,试验结果表明转基因烟草中PbrMYB21启动子活性(LUC/REN)比野生型高,试验结果与酵母单杂交试验结果相一致。为进一步确定PbrMYB21是否与PbrADC启动子中的MYB识别位点特异性结合,使用原核表达和纯化的PbrMYB21-His融合蛋白进行电泳迁移率变动分析(EMSA),试验结果表明PbrMYB21能特异性识别和绑定PbrADC基因启动子序列。使用GAL4/UAS基本系统研究转录激活或蛋白表达,化学染色表明转入融合载体烟草叶片的GUS表达量比转入空载的高。这些结果说明PbrMYB21可以转录结合PbrADC基因的的启动子。4、综上所述,本试验从杜梨中克隆了PbrMYB21基因,分别构建超表达载体和基因沉默载体。通过超表达载体将基因稳定转化到烟草、用注射法将基因沉默载体瞬时转化到30天苗龄的杜梨中。生理和分子鉴定表明该基因具有抗旱功能,其抗旱机理是PbrMYB21基因能通过转录结合ADC基因启动子,直接调控多胺的合成。