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人类活动使得以有机磷化合物为代表的环境污染物大量汇入海洋，对海洋生物及人类的健康产生潜在威胁。微生物能快速进化，以适应、利用有机磷污染物，依靠体内酶系驱动环境污染物的生物降解。有机磷化合物磷酸三酯键的水解是微生物解毒最关键的第一步，而此步反应由微生物来源的有机磷降解酶催化。有机磷化合物在地球上出现不足百年，微生物有机磷降解酶仍然处于进化中，其催化活性往往不高。利用蛋白质工程技术对有机磷降解酶进行体外进化，使其具备更优良的催化特性，对有机磷类污染的生物修复具有重要意义。本文以一种来源于海洋细菌混杂有机磷酸酐水解酶活性的脯氨酸二肽酶OPAA4301为研究对象，关注其潜在底物结合位点功能，对其进行体外分子进化以期获得催化活力提高的有机磷水解酶。取得如下研究结果: 系统阐释海洋细菌混杂有机磷水解功能肽酶OPAA4301的催化特性。酶学特性表征及系统发育分析表明OPAA4301属于M24肽酶家族的脯氨酸二肽酶，具有“非专一性”催化特征，水解Gly-Pro和对氧磷的催化效率常数分别为（7.684±1.242）×104M-1·s-1和935±89M-1·s-1，其二肽酶活性是有机磷酸酐水解酶活性的82倍，有机磷酸酐水解酶活性是其混杂活性。以有机磷为底物时该酶偏好降解磷酰基类(P=O)化合物，微弱降解磷硫类化合物。OPAA4301具有四聚体结构，单体分子量为53kDa，最适作用温度为55℃，T5015为67.88℃，最适pH为8.5。Mn2+具有催化激活作用，活性中心金属离子替换实验表明Mn2+是该酶蛋白维持催化功能的最优金属离子。 在揭示潜在底物结合残基功能的基础上，半理性设计实现肽酶OPAA4301向对氧磷水解酶的转化。对OPAA4301进行同源建模及丙氨酸扫描，发现5个金属结合位点和大口袋残基R418对酶的催化功能是不可缺少的，而其他组成底物结合口袋的10个氨基酸残基的失活对酶催化功能都具有不同程度的影响。对10个底物结合位点进行定点饱和突变筛选，获得对对氧磷水解活性提高最多的突变体D45W/H226G，相较野生酶对对氧磷的催化效率常数kcat/KM提高31.7倍，但对Gly-Pro的催化效率降低43659.1倍，产生了1.38×106倍底物特异性转换。温度特性及底物作用谱表征显示突变降低了酶的热稳定性，却拓宽了酶对有机磷化合物的底物选择性。结构分析表明，突变导致了酶的底物结合口袋体积增大，为活性中心创造了更宽阔和开放的空间，有利于酶对底物的识别和催化。 组合活性中心饱和突变试验(CASTing)法提高肽酶水解磷硫类有机磷化合物催化活性。通过构建组合饱和突变文库，以甲基对硫磷为筛选底物，获得的最优突变体D45W/L225Y/H226L/H343I对甲基对硫磷的催化效率提高10746.0倍，但对对氧磷的催化效率降低5.2倍，使得突变酶的(kcat/KM)mwthyl-parathion/(kcat/KM)paraoxon达到了73.8倍，甲基对硫磷水解活性的提高是以牺牲对氧磷水解活性来实现的。底物作用谱分析显示突变酶更偏好降解硫磷酰基类有机磷化合物。结构分析表明，突变为酶的催化活性中心创造了更宽阔和开放的疏水空间，有利于甲基对硫磷与酶活性中心充分结合，从而提高酶对甲基对硫磷的水解活性。 实现重组酶在大肠杆菌中的胞外分泌表达。为了考察OPAA4301在大肠杆菌中胞外分泌表达生产的可能性，分别从信号肽和发酵条件两方面对该酶在大肠杆菌中的产量及细胞定位情况进行观测和优化。从结果发现重组酶OPAA4301在大肠杆菌中可不依赖信号肽少量分泌至培养基上清中。以胞外酶产量为指标，对诱导剂和甘氨酸添加量进行优化，确定适宜的诱导剂浓度为0.8mM，适宜甘氨酸添加量为1％(w/v)。在优化条件下，重组酶蛋白的细胞定位主要由细胞内转变为细胞外，胞外酶活提高108.8倍，达0.28U/mL，相当于重组蛋白胞外生产能力为0.72g/L。