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类黄酮是一类重要的次生代谢物,而花青素是最为熟知的类黄酮。干旱条件下,类黄酮(特别是花青素)大量合成,所以一般认为花青素能提高植物的抗旱能力。迄今,有关类黄酮抗逆功能的研究并未关注不同类型类黄酮的作用差异,因此不同类黄酮功能是否存在差异还不清楚。黄酮醇和花青素是两种重要的类黄酮,均以二氢黄酮醇为前体,分别经FLS和DFR/ANS催化合成。实验室前期从小麦中克隆了两个合成分支酶基因TaFLS1和TaANS1,并发现黄酮醇通过促进气孔关闭、降低失水率、提高植株的抗旱能力。本研究构建了小麦和拟南芥TaANS1过表达株系,并结合TaFLS1遗传株系,初步比较了黄酮醇和花青素在非生物胁迫应答中功能的异同。1、TANS1具有花青素合成酶活性与野生型相比,TaANS1过表达小麦和拟南芥中花青素和总黄酮含量明显提高,拟南芥过表达系幼苗下胚轴、成苗叶柄处颜色加深,而ans正好相反,表明TaANS1具有花青素合成酶活性。利用HPLC及HPLC-MS分析发现,与野生型相比,TaANS1过表达小麦和拟南芥中两种主要黄酮醇槲皮素和山奈酚的含量明显降低,而ans中明显提高。Real-time PCR分析显示,TaANS1过表达拟南芥株系中花青素合成分支相关基因AtDFR、AtANS等表达明显下调,而黄酮醇合成分支相关基因AtFLS1表达则明显上调。结合前期TaFLS1过表达系相关结果,可以发现,通过对黄酮醇和花青素分支途径关键酶基因的遗传操作也改变两者间的动态平衡,而且黄酮醇和花青素均能反馈抑制其合成分支通路。2、TaANS1在抗旱中的作用和机制分析控水实验显示,与野生型相比,TaANS1过表达小麦株系抗旱性显著降低,而ans抗旱性明显提高。结果发现,与黄酮醇不同,花青素富集降低植物的抗旱能力。这一结果表明,一方面不同类黄酮在植物抗旱中的功能存在差异,另一方面,干旱胁迫下花青素虽然富集,但它并不能提高植物的抗旱能力。与野生型相比,TaANS1过表达小麦和拟南芥离体叶片失水率明显提高,而ans则明显降低,表明TaANS1过表达通过提高失水率降低抗旱能力。叶片失水率与叶片气孔密度和气孔开度相关。结果显示,T4ANS1过表达系气孔密度无显著变化;ABA处理后,TaANS1过表达小麦关闭气孔的比例低于野生型;干旱胁迫和ABA处理后,TaANS1过表达拟南芥气孔开度比野生型大,而ans比野生型小。我们利用矢车菊素和花翠素进行了药理学实验,发现添加矢车菊素能模拟TaANS1过表达对小麦和拟南芥气孔开度的影响,但花翠素则不能。结果表明,与黄酮醇相反,干旱胁迫下花青素富集通过抑制气孔关闭、提高失水率,降低植物的抗旱能力。与ABA处理结果相反,正常条件下,TaANS1过表达小麦关闭气孔的比例高于野生型,TaANS1过表达拟南芥气孔开度比野生型小,而ans相反。同样,外源矢车菊素能模拟正常条件下TaANS1过表达的作用,而花翠素则不能。结果表明:(1)与黄酮醇一样,花青素也双重调控气孔运动;(2)花青素和黄酮醇的双重调控效应正好相反;(3)与黄酮醇一样,不同类型花青素的双重调控效应不同。正常条件下,与野生型相比,TaANS1过表达系保卫细胞中H2O2水平较高,而ans中较低;ABA处理后,与野生型相比,TaAS1过表达系保卫细胞中H2O2水平降低,而ans中提高。外源矢车菊素能模拟TaANS1过表达对保卫细胞中H2O2水平的调控。结果表明,和黄酮醇一样,花青素也通过双重调控保卫细胞中H2O2水平来双重调控气孔运动。干旱胁迫下,拟南芥各株系中黄酮醇含量均明显提高,但是与野生型相比,TaANS1过表达拟南芥中提高的幅度较小,而ans中提高幅度更大。在fls突变体中,外源花青素处理不影响气孔开度和保卫细胞中H2O2水平;而在ans突变体中,外源黄酮醇处理仍然能够双重调控气孔开度和保卫细胞中H2O2水平。在chs突变体中,也发现外源黄酮醇处理能够发挥双重调控作用,而外源花青素处理则不能。结果表明,阻断黄酮醇和花青素间动态平衡时,花青素不能双重调控气孔运动,表明花青素对气孔运动的双重调控是通过动态平衡转移、黄酮醇含量变化引起的。此外,我们发现,黄酮醇富集能够提高对渗透和MV的抗性,而花青素富集则相反,表明黄酮醇和花青素也通过氧化还原稳态维持和渗透胁迫抗性调控植物的抗旱性。