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非特异性免疫是机体在长期进化过程中形成的一种可稳定性遗传的抵御外来微生物入侵的防御机制，是鱼类最基本最主要的免疫防御系统。Toll样受体是免疫系统重要组成部分，在识别病原体特定的病原相关分子模式和触发不同的抗病免疫反应方面发挥着重要作用。通过髓样分化因子依赖或非依赖途径，激活下游调控分子，诱导肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等细胞因子的分泌，最终杀灭外来病原。淇河鲫(Qihe crucian carp，Carassius auratus)为天然三倍体鲫鱼，产自豫北淇县，是“淇县三珍”之一，因其高蛋白、低脂肪、肉质细嫩、味美质佳而备受喜爱。但近年来，随着水产养殖技术的不断提高，集约化养殖规模不断扩大，水产养殖种类不断增多，导致养殖水环境进一步恶化，发病率明显升高，给水产养殖业造成巨大经济损失。因此研究淇河鲫Toll样受体基因分子特征以及中草药活性成分添加后的免疫应答，探讨其在先天性免疫中的潜在功能，对淇河鲫疾病防控具有重要的意义。
本研究以淇河鲫为实验对象，采用RACE技术克隆淇河鲫TLR9、TLR21和TLR25基因全长，分析序列特征以及在健康鱼不同组织器官中的分布。采用中草药活性成分黄芪多糖和绿原酸喂养淇河鲫，研究其对TLR基因表达的影响；然后采用嗜水气单胞菌以及聚肌胞苷酸poly(I:C)急性攻毒，分析3个TLR基因的表达响应，并研究中草药活性成分投喂对淇河鲫3个TLR基因表达的差异，以此探究中草药投喂对非特异性免疫的影响。取得主要结果如下：
1.淇河鲫CaTLR9cDNA序列全长3520bp，其中开放阅读框(Open Reading Frame， ORF)3195bp，编码1064个氨基酸；5?非编码区(5?-UTR)129bp，3?非编码区(3?-UTR)236bp。经SMART分析发现CaTLR9由1个信号肽、15个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR结构域组成。同源性分析发现CaTLR9与鲤科其它鱼类同源性高达80%，与此相一致的是基于TLR9系统进化分析表明淇河鲫与鲤科其它鱼类亲缘关系最近。CaTLR9在所检测的血液和各组织器官中均有表达，其中血液中表达量最高，其次是肌肉、肝脏和皮肤，在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激淇河鲫后，肝脏、脾和头肾中的CaTLR9表达量主要在6h、12h和24h上调。以上结果表明，淇河鲫TLR9在鱼类中高度保守，在识别细菌和病毒类似物引起机体免疫反应中发挥重要作用。
2.淇河鲫CaTLR21cDNA序列全长3290bp，其中ORF2946bp，编码981个氨基酸，5?-UTR143bp，3?-UTR201bp。经SMART分析发现CaTLR21由1个信号肽、15个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR结构域组成。同源性分析发现CaTLR21与鲤科其它鱼类同源性较高，基于TLR21的系统进化分析表明淇河鲫与鲤鱼聚为一支。淇河鲫CaTLR21在肝脏和肌肉中表达最高，其次是心脏、头肾、皮肤和肾脏，在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌感染后CaTLR21在脾脏中表达显著下调，在肝脏和头肾中有较高的表达；poly(I:C)刺激后，CaTLR21在肝脏、脾和头肾中都有不同程度地上调。以上结果显示淇河鲫CaTLR21在进化中较为保守，对病原刺激具有明显的免疫响应。
3.淇河鲫CaTLR25cDNA序列全长2596bp，包括ORF2456bp，编码817个氨基酸，5?-UTR38bp，3?-UTR104bp。经SMART分析发现CaTLR25由1个信号肽、7个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR组成。基于TLR25的同源性分析和系统进化分析结果均表明，淇河鲫同鲤科其它鱼类亲缘关系较近。CaTLR25在血液中表达量最高，其次是肌肉、皮肤和头肾，同样在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激后，CaTLR25在肝脏、脾和头肾中均有较高的表达量。以上结果说明淇河鲫CaTLR25在进化中高度保守，预示着其重要的生物学功能；同时也表明CaTLR25可能参与淇河鲫对细菌和病毒类似物的免疫响应。
4.中草药提取物黄芪多糖和绿原酸喂养淇河鲫6周后，荧光定量PCR结果表明，黄芪多糖和绿原酸可提高CaTLR9、CaTLR21和CaTLR25基因在免疫器官中的表达。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激后，检测脾脏、肝脏和头肾中基因的响应模式，结果表明中草药可以调节3个基因对病原的免疫响应。病原刺激后黄芪多糖在感染早期可促进3个基因的表达，表明黄芪多糖添加投喂可促进病原感染早期的免疫反应，有利于清除病原；而绿原酸投喂可在病原刺激后抑制3个基因的表达，延迟表达峰值出现的时间。以上结果显示，黄芪多糖和绿原酸可以促进鱼体TLRs表达，在应对病原感染时，对TLRs表达响应则呈现出不同的影响。
本研究以淇河鲫为实验对象，采用RACE技术克隆淇河鲫TLR9、TLR21和TLR25基因全长，分析序列特征以及在健康鱼不同组织器官中的分布。采用中草药活性成分黄芪多糖和绿原酸喂养淇河鲫，研究其对TLR基因表达的影响；然后采用嗜水气单胞菌以及聚肌胞苷酸poly(I:C)急性攻毒，分析3个TLR基因的表达响应，并研究中草药活性成分投喂对淇河鲫3个TLR基因表达的差异，以此探究中草药投喂对非特异性免疫的影响。取得主要结果如下：
1.淇河鲫CaTLR9cDNA序列全长3520bp，其中开放阅读框(Open Reading Frame， ORF)3195bp，编码1064个氨基酸；5?非编码区(5?-UTR)129bp，3?非编码区(3?-UTR)236bp。经SMART分析发现CaTLR9由1个信号肽、15个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR结构域组成。同源性分析发现CaTLR9与鲤科其它鱼类同源性高达80%，与此相一致的是基于TLR9系统进化分析表明淇河鲫与鲤科其它鱼类亲缘关系最近。CaTLR9在所检测的血液和各组织器官中均有表达，其中血液中表达量最高，其次是肌肉、肝脏和皮肤，在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激淇河鲫后，肝脏、脾和头肾中的CaTLR9表达量主要在6h、12h和24h上调。以上结果表明，淇河鲫TLR9在鱼类中高度保守，在识别细菌和病毒类似物引起机体免疫反应中发挥重要作用。
2.淇河鲫CaTLR21cDNA序列全长3290bp，其中ORF2946bp，编码981个氨基酸，5?-UTR143bp，3?-UTR201bp。经SMART分析发现CaTLR21由1个信号肽、15个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR结构域组成。同源性分析发现CaTLR21与鲤科其它鱼类同源性较高，基于TLR21的系统进化分析表明淇河鲫与鲤鱼聚为一支。淇河鲫CaTLR21在肝脏和肌肉中表达最高，其次是心脏、头肾、皮肤和肾脏，在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌感染后CaTLR21在脾脏中表达显著下调，在肝脏和头肾中有较高的表达；poly(I:C)刺激后，CaTLR21在肝脏、脾和头肾中都有不同程度地上调。以上结果显示淇河鲫CaTLR21在进化中较为保守，对病原刺激具有明显的免疫响应。
3.淇河鲫CaTLR25cDNA序列全长2596bp，包括ORF2456bp，编码817个氨基酸，5?-UTR38bp，3?-UTR104bp。经SMART分析发现CaTLR25由1个信号肽、7个LRR基序、1个跨膜结构域以及1个TIR组成。基于TLR25的同源性分析和系统进化分析结果均表明，淇河鲫同鲤科其它鱼类亲缘关系较近。CaTLR25在血液中表达量最高，其次是肌肉、皮肤和头肾，同样在卵巢中表达量最低。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激后，CaTLR25在肝脏、脾和头肾中均有较高的表达量。以上结果说明淇河鲫CaTLR25在进化中高度保守，预示着其重要的生物学功能；同时也表明CaTLR25可能参与淇河鲫对细菌和病毒类似物的免疫响应。
4.中草药提取物黄芪多糖和绿原酸喂养淇河鲫6周后，荧光定量PCR结果表明，黄芪多糖和绿原酸可提高CaTLR9、CaTLR21和CaTLR25基因在免疫器官中的表达。嗜水气单胞菌和poly(I:C)刺激后，检测脾脏、肝脏和头肾中基因的响应模式，结果表明中草药可以调节3个基因对病原的免疫响应。病原刺激后黄芪多糖在感染早期可促进3个基因的表达，表明黄芪多糖添加投喂可促进病原感染早期的免疫反应，有利于清除病原；而绿原酸投喂可在病原刺激后抑制3个基因的表达，延迟表达峰值出现的时间。以上结果显示，黄芪多糖和绿原酸可以促进鱼体TLRs表达，在应对病原感染时，对TLRs表达响应则呈现出不同的影响。