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骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)是一群存在于骨髓中的非造血干细胞，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能。体外分离培养BMSC，在一定的诱导条件下，BMSC可以定向分化为成骨细胞，成骨细胞作为骨组织形成过程中的一种重要细胞，在骨缺损的修复过程中起关键作用，特别对构建用于修复骨缺损的组织工程骨尤其重要。骨钙素(osteocalcin，OCN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表达水平可作为成骨细胞鉴定和功能状态评价的指标。
骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一种细胞基质中的非胶质蛋白质，BSP在骨发生时可启动矿化晶体的生长，能够介导成骨细胞与骨矿物质的结合，与骨的分化、组织形成和再塑有关；同时BSP具有良好的成骨效应。因此，研究BSP对BMSC向成骨细胞分化的影响及其作用机制，有可能为组织工程骨在临床的推广应用提供技术基础。本课题用改良的骨髓培养法体外分离、扩增培养BMSC；定向诱导其向成骨细胞分化，进行成骨鉴定。通过添加rhBSP和真核表达质粒pEGFPCI-mBSP转染BMSC，初步研究。BSP对BMSC成骨分化的影响。主要研究结果如下：
1．通过改良的骨髓培养法原代培养BMSC，不但提高了BMSC的分离率和增殖能力，而且使分离时间缩短、污染机会减少、工作效率提高。
2．分离培养的大鼠、小鼠BMSC均呈纤维状，梭形，有突起，约7～9d时，细胞汇合成片，其融合率可达到80％；消化传代后的细胞较原代细胞体积大，呈不规则的多角形，有短而薄的胞质突起，且贴壁较快，12h后贴壁率可达80％以上；小鼠BMSC超微结构表现出早期细胞的特点。不同密度接种小鼠BMSC结果显示，最佳接种密度为1×10<4>～6×10<4>个/mL。小鼠BMSC传代后细胞第1～3d处于潜伏适应期；第4～8d进入对数生长期；而后增殖相对缓慢开始进入生长平台期。细胞周期检测显示，100％细胞都是二倍体，88％以上的细胞处于静止期细胞，仅少数细胞处于增殖活跃期。STRO-1免疫组化和免疫荧光细胞检测结果显示，所分离培养的小鼠、人BMSC胞浆中表达STRO-1。
3．定向诱导小鼠BMSC、大鼠BMSC向成骨细胞分化，10d～12d时细胞间出现了较多散在的致密圆形矿化结节，结节周围的细胞密度较高，轮廓不清，结节中心透光性差，符合成骨细胞的形态学特征。成骨诱导2周的第1代小鼠BMSC的细胞周期结果显示，100％细胞都是二倍体，其中S+G<,2>期细胞约占11.72％，而处于G<,l>期的细胞约占87.28％，即诱导的细胞大部分处于分裂前的静止期。成骨诱导2周的大鼠BMSC的OCN表达呈明显阳性。小鼠和大鼠BMSC经成骨诱导2周后，ALP染色为阳性，并随培养时间延长逐渐增强；同时细胞呈复层生长，出现Von kossa染色阳性的矿化结节，提示矿化基质沉积。
4．小鼠BMSC中添加rhBSP的最佳浓度为10<-10>mol/L～10<-11>mol/L，对BMSC的生长起一定的促进作用，但是随着成骨诱导时间的延长，成骨诱导剂促进BMSC的成骨分化，而相对抑制其增殖。小鼠BMSC经含rhBSP的成骨诱导液连续诱导培养2周后，细胞呈复层生长，并出现不透明结节；Von Kossa染色可见矿化结节颗粒变大，数量增多，矿化基质沉积明显，初步提示rhBSP具备促进组织矿化、成骨细胞与矿化基质结合的功能，表明rhBSP具有良好的成骨诱导性。真核表达质粒pEGFPCI-mBSP通过脂质体介导的方式转染小鼠BMSC，转染36h后小鼠BMSC中瞬时表达GFP蛋白。