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[目的]
1观察Pokemon和Bim在大肠慢性炎、大肠腺瘤、大肠癌组织中的表达及其关系。
2明确Pokemon在大肠癌细胞LOVO和HCT116中对Bim基因表达的影响。
3探讨在大肠癌细胞中改变Pokemon表达联合化学药物顺铂(Dichlorodiamineplatinum,DDP)处理应用对Bim表达的影响。
[方法]
1免疫组织化学方法检测大肠慢性炎、大肠腺瘤和大肠癌组织中Pokemon,Bim的表达情况。统计分析二者表达的相关性。
2用脂质体法将Pokemon表达质粒以及阴性对照质粒瞬时转染HCT116细胞(Pokemon不表达),分别为Pokemon过表达细胞(Overexpression Pokemon,OP细胞)和阴性对照细胞(Negative Control,NC细胞)。用小分子RNA稳定敲减LOVO细胞(Pokemon高表达)的Pokemon,建立Pokemon敲减细胞株(Knockdown,KD细胞)和阴性对照细胞株(Negative Control,NC细胞)。用qRT-PCR和Western blot分别检测这些细胞的Pokemon和Bim的mRNA和蛋白水平。
3给LOVO-NC、KD及HCT116-NC、OP细胞加入化学抗癌药物顺铂后,用qRT-PCR和Western blot检测这些细胞的Bim mRNA和蛋白水平。
[结果]
1在大肠病变组织中,Pokemon和Bim的表达情况及相关性:
(1) Pokemon蛋白在大肠慢性炎,大肠腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为23.5%、44%、81.7%,三者比较有统计学意义(P<0.05);
(2) Bim蛋白在大肠慢性炎,大肠腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为96.1%、70%、32.7%,三者比较有统计学意义(P<0.05);
(3)低分化腺癌的Pokemon阳性表达率为100%,比高分化腺癌的63.6%显著升高,而Pokemon阳性表达率与性别、年龄、肿瘤部位、Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移无关;高分化腺癌的Bim阳性表达率为40.9%,比低分化腺癌的23.1%显著升高,直肠癌的Bim阳性表达率为43.5%,比结肠癌的24.1%显著升高,而Bim阳性表达率与性别、年龄、Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移无关;
(4)根据Spearman等级相关分析结果:不同大肠病变组织Pokemon蛋白表达与Bim蛋白表达之间呈负相关,相关系数r=-0.426(P<0.01)。
2 Pokemon-KD细胞与Pokemon-NC细胞相比,Pokemon mRNA下调了70%,蛋白表达量下降62.2%; Bim mRNA表达量增高76%,蛋白水平变化不够明显。在Pokemon过表达的HCT116细胞,Bim mRNA水平下调79.8,而蛋白水平变化不够明显。
3在LOVO细胞中,Pokemon-KD联合顺铂处理与顺铂单独处理相比,Bim mRNA表达量提高了51.8%,蛋白表达量提高了50%;在HCT116细胞中,Pokemon-OP联合顺铂处理与顺铂单独处理相比,Bim mRNA表达量下调了67.1%,蛋白表达量下调了64%。
[结论]
1 Pokemon和Bim的表达从大肠炎症、腺瘤到大肠癌组织中分别显著增高和显著降低,表明两者的表达与大肠癌的发生发展密切相关。在大肠癌组织中Pokemon和Bim的表达呈高度负相关,表明两者具有拮抗或调控关系。
2在大肠癌细胞中敲减或转染Pokemon,Bim mRNA水平显著升高或降低,但蛋白水平变化不明显,表明Pokemon强力抑制Bim的转录但不太影响翻译。
3在大肠癌细胞中,在顺铂介入的情况下,Pokemon对Bim的mRNA稳定水平的调控程度虽然有所降低,但使Bim出现了显著的蛋白水平改变,表明在顺铂介入的情况下,Pokemon对Bim蛋白调控功能得以充分展现,而且敲减Pokemon联合顺铂用药具有很好的临床运用前景。