论文部分内容阅读
目的拟对课题组前期运用iTRAQ联合LC-MS/MS技术筛选出的慢性乙型肝炎(CHB)肝郁脾虚、脾胃湿热证的血清特异性表达蛋白进行验证。首先拟获取肝郁脾虚、脾胃湿热证的历史沿革和二证证本质现代研究概况、已得成果、以及问题和不足,为实验研究提供理论参考。其次拟运用Western Blot技术对筛选出的FETUA、 PLTP、PF4V等5个特异性表达蛋白进行验证,以验证其可靠性。方法本文主要从文献研究和实验研究两个方面展开。首先对肝郁脾虚、脾胃湿热两证的相关文献进行纵向和横向研究。纵向研究为：探索二的源流脉络和历史沿革;横向研究为：采用题名和摘要相结合的方法在清华同方CNKI系列数据库检索二证的证本质研究文献,检索日期为起始日期不限至2016年1月1日,最终纳入肝郁脾虚证157篇,脾胃湿热证129篇,并对纳入的文献从年度分布、相关疾病、分子研究等方面进行计量和频数分析。其二,纳入CHB肝郁脾虚证、脾胃湿热证样本各9例,正常对照样本6例,运用Western Blot技术检测其上述5种血清特异性蛋白在各组间的表达变化情况,并用GraphPad Prism 5软件分析各组蛋白的灰度值。结果1.通过文献研究发现：肝郁脾虚、脾胃湿热证证本质研究大多采用方证相关、病证结合方式；研究涉及的疾病,肝郁脾虚证以乙型肝炎为主,占比达33%,脾胃湿热证以各种胃炎为多,占比达58%；分子机制方面：肝郁脾虚证轴研究以下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺、甲状腺、肠腺)为热点,信号通路研究有几十条之多,未见统一者,蛋白的研究则涉及神经、内分泌、消化、免疫等多系统；脾胃湿热证则主要集中于肠道甜味觉通路中受体细胞及信号关键分子和NF-KB炎症信号通路两条通路,蛋白研究包括水通道蛋白(AQP),热休克蛋白(HSP),血液中胃动素(MTL)等数十种蛋白。2.CHB肝郁脾虚证组和正常组比较：PF4V、PSMA6差异有统计学意义(P<0.05),PF4V前期筛选下调,验证亦下调,趋势相符；PSMA6前期筛选上调,验证亦上调,趋势相符。CHB脾胃湿热证组和正常组比较：FETUA、CATC、PLTP差异有统计学意义(P<0.05), FETUA、CATC、PLTP前期筛选上调,此次验证亦上调,3者表达趋势筛选、验证均相符。3.上述验证蛋白表达谱与文献分析结果以及课题组其它组学结果汇总分析发现,某些通路和蛋白功能有相似性,但并未完全重合。CHB肝郁脾虚证的分子机制与酶活性调节、免疫反应、趋化因子介导的信号转导通路、血小板活化等功能相关；CHB脾胃湿热证的分子机制与炎症反应、脂质结合、免疫反应等功能相关。结论1.上述二证现代证本质的研究结果较为丰富,但也存在差异性较大、特异性较差的问题,因此应尝试建立病证结合的肝郁脾虚证、脾胃湿热证多指标联合诊断；另外,随着组学技术的整体性研究特色逐渐展现,其广泛运用于未来中医证本质的研究必然是大势所趋。2.经过前期筛选和本次验证,PF4V、PSMA6作为CHB肝郁脾虚证的证候特异性表达蛋白较为可靠；FETUA、CATC、PLTP作为CHB脾胃湿热证证候特异性表达蛋白较为可靠。3.获取的CHB肝郁脾虚证和脾胃湿热证蛋白表达谱和其他及本课题组其它组学成果间存在某些关联,但并未完全重合,故下一步需运用对证候疗效确切药物进行干预,以动态观察上述指标的变化。