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背景和目的:肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮,故亦称为支气管肺癌。据世界卫生组织(WHO)统计,近几年来每年肺癌的新发病率超过130万,而因肺癌死亡的人数高达110万,肺癌已成为全球男性和女性的第一杀手。在肺癌患者的传统治疗手段中,放射治疗在肿瘤的局部控制和缓解转移性病变所致症状中发挥着重要作用。然而,肿瘤细胞放射抵抗性的产生往往导致肺癌患者的长期生存率极低,因此,迫切需要发展更为有效的综合抗癌手段。近些年来放射生物学研究显示,处于不同的细胞周期中的细胞对放射线呈现不同的放射敏感性。因此,许多对肿瘤放疗增敏的关注点也就转移到细胞周期的调控方面。细胞周期由相应的周期蛋白进行调控,现已证实共济失调毛细血管扩张突变蛋白(Ataxia Telangiectasia mutated protein, ATM protein)在这一过程中发挥着关键的调控作用。含非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸基序(CpG motifs)的寡聚脱氧核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG ODN)能够刺激机体免疫系统,从而增强机体免疫力而产生多种抗肿瘤效应,近年来文献报道CpG ODN可直接作用于肿瘤细胞而抑制其增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡。本课题组在之前的体外细胞实验中,观察到终浓度为10μg/ml CpG ODN7909对人肺腺癌A549细胞的增殖活力抑制作用最为明显。因此,本次实验进一步探讨CpG ODN7909对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及ATM蛋白激酶在这过程中的潜在作用。方法:选用人肺腺癌A549细胞株作为研究对象。将细胞随机地分为6组:空白对照组、CpG组、X线照射组、CpG+X线照射组、ATM-siRNA+CpG+X线照射组和Control-siRNA+CpG+X线照射组。其中,空白对照组不作任何处理:CpG组给予10μg/ml的CpG处理24小时,X线照射组给予细胞10Gy剂量X射线照射;CpG+X线照射组先给予细胞10μg/ml的CpG处理24小时后再予以10Gy剂量X射线照射;ATM-siRNA+CpG+X线照射组和Control-siRNA+CpG+X线照射组分别先将细胞进行ATM-siRNA和Control-siRNA转染并继续培养24小时,接下来处理方法同CpG+X线照射组。在细胞集落形成实验中,各组均在X射线照射后第10天在显微镜下计数细胞集落形成数;细胞凋亡和细胞周期的实验中,各组均在X射线照射后24小时采用流式细胞仪分析;在Western-blotting实验中,各组均在X射线照射后3小时收集样品。结果:空白对照组和CpG组中A549细胞集落形成、细胞凋亡及周期分布无明显差异;X线照射组中A549细胞集落形成减少、细胞凋亡增加及G2/M期细胞数量增多,而CpG+X线照射组中A549细胞集落形成进一步减少、凋亡的细胞数及G2/M期细胞数进一步增多,且同单纯X线组相比,两者差异具有统计学意义;在ATM-siRNA+CpG+X线照射组中,A549细胞集落形成数较CpG+X线照射组增多,而细胞凋亡数量及G2/M期细胞数较CpG+X线照射组减少,两组间有统计学差异;Control-siRNA+CpG+X线照射组和CpG+X线照射组相比,两者在细胞集落形成、细胞凋亡和细胞周期分布之间的差异无统计学意义。Western-blotting检测显示除ATM-siRNA+CpG+X线照射组外,各组A549细胞内ATM激酶及其下游底物如Chk2和p53蛋白表达无明显变化,而且在空白对照组和单纯CpG组中,上述蛋白未出现明显的磷酸化;X线照射组和CpG+X线照射组中ATM. Chk2和p53蛋白均出现了磷酸化,其中以CpG+X线照射组的蛋白磷酸化更加明显;ATM-siRNA+CpG+X线照射组和Control-siRNA+CpG+X线照射组的比较显示了ATM-siRNA特异性的抑制了ATM激酶的表达,而整个转染体系对蛋白的表达无影响。结论:CpG ODN7909在体外可以增强X射线对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制、促凋亡以及G2/M期阻滞作用,从而提高人肺腺癌A549细胞的放射敏感性。这一作用可能与ATM激酶的磷酸化水平增加有关。