α-酮戊二酸是一种重要的短链羧酸,在食品、医药和化妆品等行业有广泛的应用。在顺乌头酸酶（aconitase,ACO,EC 4.2.1.3）的作用下,柠檬酸可以通过脱水与加水反应生成异柠檬酸,异柠檬酸又可在异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH,EC 1.1.1.42）的催化作用下,氧化脱羧生成α-酮戊二酸及CO₂,同时将辅酶NADP⁺转变成其还原形式NADPH。柠檬酸来源丰富、价格低廉,ACO和IDH复合物组装的共固定化,为α-酮戊二酸的生产探索了一条新途径。本实验以ACO和IDH为研究对象,分别将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的ACO和IDH基因在大肠杆菌中进行表达、纯化,对IDH进行酶活性和动力学参数的测定,为ACO和IDH的定向、共价固定化奠定了基础。本实验以ACO和IDH作为固定化研究的目的蛋白,将大肠杆菌的ACO基因acnA、acnB与IDH基因icd1,以及枯草芽孢杆菌的ACO基因cit B和IDH基因icd2分别融合了His标签和可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（Sfp）修饰的短肽SRP标签,成功构建了pET30a-His-SRP-acnA、pET28b-His-SRP-acnB、pET28b-His-SRP-icd1、pET28b-His-SRP-cit B、p ET28b-His-SRP-icd2五个重组表达载体,表达和纯化出目的蛋白,并将其分别命名为ACO1、ACO2、IDH1、ACO3、IDH2。同时对IDH1和IDH2进行了酶活性和动力学参数测定,经过多次重复实验,结果显示,IDH1和IDH2的活性分别为36.40 U、30.23 U,K_m值分别为0.14 mM和0.05 mM,K_cat值分别为152.84 s^-1和111.06 s^-1,因此在底物充足时,IDH1比IDH2的催化效率高。在此基础上,本实验选择一个与特定DNA结合能力强、长度为243 bp的锌指结构域基因zif,将其与大肠杆菌icd1融合,构建了p ET30a-zif-TEV（RS）-icd1-SRP-His、pET28b-His-SRP-icd1-TEV（RS）-zif两个表达载体,进行诱导表达和纯化,并将两种酶分别命名为IDH3和IDH4。此外,对IDH3和IDH4的酶动力学参数的测定的结果显示,IDH3和IDH4的K_m值分别为0.15 mM和0.15 mM,与前面IDH1和IDH2的K_m值测定结果差异不大。但IDH3和IDH4活性和K_cat值却表现出明显差别,IDH3和IDH4活性分别为1.29 U、3.70 U,K_cat值分别为14.44 s^-1和39.67 s^-1,显然底物充足时,IDH3的催化效率远远大于IDH4。