目的:多发性硬化不仅是中枢神经系统的自身免疫性疾病，也是一种神经变性疾病，其发病率和地理纬度具有明显相关性，越远离赤道，多发性硬化的发病率越高。本实验选用1，25(OH)2D3作为干预药物，研究其治疗多发性硬化的有效性，不仅研究其对中枢神经系统白质髓鞘的影响，还深入研究对灰质神经元的作用，并进一步探索其潜在的作用机制。　　方法:将27只周龄在8-10周左右，体重在18-20g左右的C57BL/6雌性小鼠随机分为正常对照组，EAE组，VD3组(即1，25(OH)2D3给药组），各组均为9只。　　以MOG多肽为抗原免疫后两组小鼠建立EAE动物模型。以250μg人工合成MOG35-55多肽溶到500μl生理盐水中，和等体积含1mg/ml结核菌素的完全福氏佐剂(CFA)混合，加入结核杆菌H37Ra使结核菌素补充至400ng，充分混匀至油包水乳剂，制成完全抗原，双侧背部分4点皮下注射。于免疫后的第0和48h两次给予小鼠腹腔内注射500ng的百日咳毒素，以建立小鼠的EAE模型。免疫当天记为0天。VD3组小鼠自免疫当天起每隔两日腹腔注射0.1ml1，25(OH)2D3(用洁净蓖麻油稀释至浓度为1ug/ml)，空白对照组和EAE组小鼠均同天腹腔注射0.1ml蓖麻油，直至处死。从免疫当天开始，每天早晚(8:00和16:00)两次由两位观察者分别对各组小鼠进行神经功能的评分、称重并给予记录。于免疫后第20天，对三组小鼠进行取材。断颈处死小鼠后，对小鼠大脑组织新鲜取材，切分成两部分，前三分之一，后三分之二（此部分以下称为侧脑室旁脑组织），一部分迅速投入液氮进行快速冷冻，后置于一80℃冰箱保存，进行WesternBlot检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达情况;对脊髓腰骶膨大组织新鲜取材后置于4％多聚甲醛保存，部分制成石蜡切片，进行HE、LFB、Nissl染色，观察炎性细胞的浸润、脱髓鞘情况及神经元形态数目变化;剩余部分的侧脑室旁脑组织和腰骶膨大组织则制成冰冻切片，进行免疫荧光法检测，分别单染NeuN观察神经元的变化，双染NeuN和Beclin1， NeuN和LC3，观察神经元自噬水平的变化。　　数值采用“均数±标准差”表示，EAE发病率应用Fishers确切概率法，临床评分应用Mann-Whitney U检验。两组间炎性浸润及脱髓鞘对比应用t检验。多组间的计量资料均数比较应用One-Way ANOVA检验，两两比较应用SNK-q检验或Dunnetts检验。P＜0.05具有统计学意义。　　结果:　　1、1，25(OH)2D3有效改善EAE小鼠的临床症状　　空白对照组（Control组）小鼠均未发病，活动、食欲等方面均正常。EAE组小鼠发病率达100％，自免疫第一天即出现不同幅度的体重下降，之后逐渐出现活动减少、尾巴无力、反应不灵敏和皮毛不光滑等症状。1，25(OH)2D3治疗组（VD3组）小鼠至取材发病率仅为11.1％(P＜0.01)。通过比较后两组中小鼠每天的神经功能评分的均数发现，自第11天开始，VD3组小鼠的神经功能评分显著地低于EAE组小鼠（第11天，P＜0.05;之后P＜0.01）。　　2、1，25(OH)2D3明显减轻EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润及髓鞘脱失　　2.1小鼠腰骶膨大组织HE染色示:Control组小鼠未见炎性细胞的浸润及“血管袖套”样情况;处于发病高峰期的EAE组小鼠脊髓组织切片内可见弥漫的炎性细胞浸润，个别的切片内存在“血管袖套”样改变;VD3组小鼠脊髓组织基本未见炎性细胞浸润征象。HE染色病理评分存在统计学差异。　　2.2小鼠腰骶膨大LFB染色示:Control组小鼠未见明显髓鞘脱失情况;EAE组发病高峰期小鼠脊髓白质内可见成片的髓鞘脱失区域，呈现白色空泡样变;VD3组小鼠脊髓白质内髓鞘基本完整，未见明显脱失区域。LFB染色病理评分存在统计学差异。　　3、1，25(OH)2D3有效预防EAE小鼠脊髓灰质神经元的脱失　　3.1小鼠腰骶膨大Nissl染色示:与Control组相比，EAE组小鼠脊髓灰质内Nissl标记的神经元数目显著减少（P＜0.01），且呈现不同程度的神经元损伤，如明显核皱缩、尼氏体数目减少等现象。而VD3组小鼠脊髓内Nissl标记的神经元数目则较EAE组增多(P＜0.01)。　　3.2免疫荧光染色显示:与Control组相比，EAE组小鼠脊髓灰质内NeuN标记的神经元数目明显减少，而VD3组小鼠脊髓内NeuN标记的神经元数目则较EAE组增多。　　4、发病高峰期的EAE小鼠体内自噬水平存在异常，1，25(OH)2D3可调控EAE小鼠的自噬水平　　4.1免疫印迹示:发病高峰期的EAE小鼠与Control组小鼠相比，Beclin1的表达明显下降，差异显著(P＜0.05)，而VD3组小鼠Beclin1的表达则较EAE组小鼠明显升高（P＜0.05）。而LC3-Ⅱ在各组的表达则呈现出相反的趋势，可见发病高峰期的EAE小鼠与Control组小鼠相比，LC3-Ⅱ的表达明显升高(P＜0.01)，而VD3组小鼠LC3-Ⅱ的表达则较EAE组小鼠明显降低(P＜0.05)。增设EAE氯喹干预组，显示发病高峰期的氯喹治疗组小鼠与EAE组小鼠相比，LC3-Ⅱ的水平未见明显变化。　　4.2免疫荧光示:在Control组小鼠神经元内可检测到Beclin1呈一定水平的表达，而在发病高峰期的EAE小鼠神经元内Beclin1的表达明显降低，神经元数目有所减少。在VD3组可见Beclin1表达弥漫性增强。在Control组及VD3组小鼠神经元内几乎检测不到LC3的表达，而在发病高峰期的EAE小鼠神经元内LC3表达增强。　　结论:　　1、自噬参与了多发性硬化的发生。在发病高峰期的EAE小鼠体内存在自噬体降解受阻的现象。　　2、1，25(OH)2D3不仅可以减轻EAE小鼠白质炎性脱髓鞘现象，还可以改善神经元受损和脱失情况，而1，25(OH)2D3可通过调节神经元自噬水平发挥神经保护作用。综上，本实验证明1，25(OH)2D3及其类似物，或其他神经元自噬调节剂有望成为治疗多发性硬化的新方向。