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颜面部正常发育依赖于颜面部的五大始基以及神经嵴细胞的增殖,移行以及这些过程时间和空间上的精确调控,最终使得颜面部始基在中线上相遇,同时伴随着上皮层细胞的部分凋亡和EMT转化实现最终的组织融合。这一过程可受到遗传和环境等多因素的影响,造成包括唇腭裂在内的颜面部畸形。目前已知有多个基因参与了颜面部早期胚胎发育的调控,其中MID1,MID2,IRF6,MSX1,PTCH1,PVRL1,p63和JAG2的突变在综合征型和散发型唇腭裂中都有报道,被认为是唇腭裂相关基因。然而这些基因的具体分子功能以及它们是否通过影响共同的信号通路来参与唇腭裂发生的分子病理目前还不清楚。目的:研究IRF6和MID1在早期颜面部发育中的分子功能,研究它们对于细胞增殖,移行,凋亡以及EMT的影响,探讨唇腭裂形成的分子病理。方法:1、采用RT-PCR,PCR,酶切,连接和转化等分子克隆技术构建IRF6、MID1真核表达载体,通过PEI介导使细胞过表达IRF6、MID1;2、在Sigma公司合成IRF6、MID1基因特异性si RNA,通过PEI介导利用RNA干扰技术建立IRF6、MID1基因沉默模型;用Western-blot、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)从蛋白和m RNA水平检测IRF6、MID1表达情况。3、用划痕法观察IRF6、MID1基因突变后细胞的迁移能力;4、CCK8法检测细胞的增殖能力,以及流式细胞仪测试细胞的凋亡情况;5、利用Western-blot、q RT-PCR以及免疫荧光定位技术,检测和定位EMT标志性分子E-cadherin、vimentin在细胞内表达情况以及位置,从而比对MID1和IRF6突变后的E-cadherin和vimentin表达变化。结果:1、经划痕法观察,在MID1和IRF6基因沉默模型中,293T细胞的迁移能力显著高于对照组(P<0.001)。2、CCK8法检测结果显示,在MID1的表达被干扰后,293T细胞增殖能力远低于空白对照组(P<0.001),而在IRF6表达沉默后,293T细胞增值能力增加。3、细胞凋亡检测中,MID1、IRF6的沉默不会影响细胞的凋亡。4、经检测显示,MID1-si RNA-1678组的E-cadherin表达低于空白对照组中的表达低于实验组,vimentin表达增加,,EMT增强,IRF6-si RNA-869组E-cadherin表达高于空白对照组vimentin表达减少,EMT被抑制。5、免疫荧光显示,MID1-si RNA-1678组的E-cadherin在膜和胞质中减少,IRF6-si RNA-869组中E-cadhrin的表达除了膜和胞质外,细胞核中也有所分布。结论1、MID1沉默导致细胞增殖受到影响,MID1能够促进细胞的增殖;2、MID1基因表达下调后,E-cadherin表达下调EMT增强,MID1对EMT的发生起抑制作用;3、IRF6基因沉默造成细胞增殖增加,IRF6抑制细胞的增殖;4、IRF6的表达下调导致E-cadherin表达上调,从而抑制细胞发生EMT,因此IRF6能够促进细胞的EMT。5、MID1、IRF6对细胞的凋亡没有影响。6、MID1、IRF6能够抑制的迁移。