肠纤维化是炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)发病过程中一种常见的严重并发症,最终可导致肠腔狭窄甚至肠梗阻发生。由于其发病机制尚未明确,迄今尚无理想治疗方案。因此,深入研究IBD相关肠纤维化的发病机制可能为临床治疗肠纤维化提供新的理论和实验依据。肠纤维化的发生是一个复杂动态的过程,主要由于免疫反应失衡,肠道细胞因子如：转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等表达发生改变,进而促进以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix, ECM)过度沉积所致。肠成纤维细胞被认为是肠纤维化发生的关键效应细胞。已有研究证实,肠成纤维细胞(intestinal fibroblasts, IFBs)、效应细胞在上述细胞因子作用下活化,自身发生向肠肌成纤维细胞(intestinal myofibroblasts, IMFs)转化,其增殖、迁移以及合成与分泌ECM的功能增强,ECM在肠壁大量沉积,最终导致肠纤维化和狭窄形成。由于慢性炎症的持续存在,肠道间质细胞分泌的胶原代谢酶调节平衡发生紊乱,主要包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs),这些酶作用失衡导致ECM合成明显多于降解,最终导致肠纤维化形成。有研究表明,在IBD发病过程中,MMPs和TIMPs调节胶原代谢的功能失衡。同时,各种细胞因子改变间质细胞生物学行为离不开细胞内信号转导通路的调节。TGF-β1/Smad3信号通路在纤维化过程中是一条最主要的信号传导通路。有研究证实,肠纤维化发生过程中TGF-β1/Smad3表达与功能明显上调,由其调节的间质细胞活化亦增强。因此,探讨促纤维化因子及其信号通路在肠纤维化中的作用对研究其发病机制具有重要意义。肿瘤坏死因子样配体lA(tumor necrosis factor-like ligand1aberrance, TL1A)是肿瘤坏死因子超家族成员15(TNF superfamily member15, TNFSF15)基因的蛋白产物,可通过与其受体--死亡受体3(death receptor3,DR3)结合,为T淋巴细胞的分化提供协同刺激信号,影响机体免疫调节。近来对TL1A的研究表明,TL1A与IBD密切相关,TNFSF15基因诱导TL1A的表达促进了IBD的发生与进展,INFSF15基因作为IBD的易感基因已得到证实。Dr.Targan及其课题组成员研究证实,TL1A及其受体可通过影响肠黏膜T细胞的活化、增殖,诱导Th细胞极化,从而导致肠黏膜免疫系统耐受调节紊乱,由此引发肠道炎症反应,从而参与IBD的发生。新近的研究进一步发现TL1A过表达转基因小鼠结肠炎模型出现肠炎并发肠纤维化改变。这些都证实了TL1A在IBD肠黏膜T细胞介导的免疫反应中发挥重要作用,其表达促进了肠黏膜的炎症和纤维化发生。尽管TL1A在肠道炎症中的研究已取得进展,但其在肠道纤维化发生中的作用机制仍不明确,且干预TL1A能否成为逆转肠纤维化的新靶点尚需进一步探究。为此,本实验利用野生型(wild type, WT)C57BL/6小鼠及转基因(LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic, L-Tg)两种遗传背景的小鼠建立实验性结肠炎并发肠纤维化模型,研究TL1A在诱导小鼠肠纤维化中的作用,并探讨肠纤维化过程中肠成纤维细胞以及胶原代谢的改变,旨在揭示TL1A在实验性结肠炎相关肠纤维化发生中的机制,为探索防治肠纤维化的新靶点提供实验依据。实验内容主要包括以下三部分：第一部分TL1A在TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎炎症中的作用目的：建立TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠模型,探讨TL1A在TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎肠黏膜炎症中的作用。方法：①采用real-time Q-PCR方法进行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鉴定与筛选；②通过三硝基苯磺酸(Trinitro-benzene-sulfonic acid, TNBS)乙醇溶液灌肠建立实验性结肠炎模型,L-Tg小鼠与C57BL/6WT小鼠(6-8周)随机分为Control/WT组、EtOH/WT组、TNBS+EtOH/WT组、Control/Tg组、EtOH/Tg组、TNBS+EtOH/Tg组,每组6只；TNBS+EtOH组小鼠禁食24h,乙醚麻醉后将聚乙烯导管插入肛门约1cm注入50μLTNBS乙醇溶液,继续深入至脾区(约3cm～4cm)再注入100μL灌肠液,每周重复灌肠1次,于第1-2周给予2.0mg TNBS,第3-4周给予3.0mgTNBS,最后一次灌肠后第三天处死,EtOH组和Control组分别使用等体积的50%乙醇和蒸馏水溶液灌肠作为对照；③小鼠结肠炎及肠黏膜炎症评估包括每天体重(Body weight, BW)改变、疾病活动指数(Disease activity index, DAI)、结肠形态学改变和病理评分以及髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)检测；④ELISA法测定血清TNF-α、干扰素-y(Interferon-y, IFN-y)和白细胞介素17A(Interleukin, IL-17A)的水平；⑤Western blot和real-time Q-PCR技术测定肠道组织中TNF-α、IFN-γ、IL-17A的蛋白和mRNA水平。结果：①根据基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列测定小鼠DNA,目的基因在Tg小鼠成像在192bp位置,而WT小鼠基因测定成像,在192bp位置未检测到目的基因,据此可以筛选鉴定Tg小鼠；②在两种小鼠中,与Control组和EtOH组相比,TNBS+EtOH组小鼠经TNBS乙醇溶液灌肠后,出现厌食、精神状态萎靡、体重下降、DAI评分与病理评分增加,结肠质地变硬,长度缩短,肠壁出现水肿、充血,结肠组织病理切片显示肠道结构破坏,黏膜及黏膜下层出现中性粒细胞浸润；两种小鼠的Control组和EtOH组肠道改变均无明显差异,TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组肠道炎症反应增强；㈢MPO结果显示：在WT和Tg小鼠组,与Control组和EtOH组相比,TNBS+EtOH组小鼠结肠MPO活性明显升高,而两种小鼠的Control组和EtOH组间MPO均无明显差异,TNBS+EtOH/Tg组结肠MPO活性较TNBS+EtOH/WT组显著升高；④ELISA结果显示：在WY和Tg小鼠组,TNBS+EtOH组小鼠血清TNF-α IFN-γ、IL-17A水平较Control组和EtOH组明显升高,两种小鼠的Control组和EtOH组血清细胞因子无明显差异,同时TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组升高更为明显；⑤应用Western blot和real-time Q-PCR技术检测小鼠肠组织中TNF-α、IFN-γ和IL-17A的表达,结果显示,TNBS+EtOH/WT组较Control/WT组小鼠肠组织炎症因子表达升高,TNBS+EtOH/Tg组较Control/Tg组小鼠肠组织炎症因子表达升高,同时TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组升高更明显,在两种小鼠的Control组和EtOH组肠道中表达无明显差异。结论：通过TNBS灌肠方法成功建立了实验性结肠炎模型,TL1A能促进TNF-α、IFN-γ和IL-17A产生,上调Th1和Th17介导的免疫反应,从而增强实验性结肠炎小鼠肠道黏膜炎症的发生。第二部分TL1A在TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎相关肠纤维化发生中的作用与机制研究目的：深入探讨TL1A在TNBS诱导实验性结肠炎相关肠纤维化发生中的作用及机制。方法：①造模方法与实验分组同第一部分；②Masson’s trichrome staining(MT染色)、天狼猩红染色检测胶原沉积评估肠纤维化程度改变；③采用免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原、TIMP-1、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)以及TGF-β1/Smad3在小鼠结肠组织中的的表达；④Western blot和real-timeQ-PCR技术测定肠组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA、 TGF-β1/Smad3蛋白和mRNA水平。结果：①MT染色和天狼猩红染色显示,在TNBS诱导的WT和Tg小鼠实验性结肠炎模型中,与Control组小鼠相比,TNBS+EtOH组小鼠结肠黏膜下层和浆膜层出现大量胶原沉积,而两类小鼠的Control组和EtOH组均无明显差异,TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组改变更为明显；②采用免疫组织化学染色显示,在WT和Tg小鼠组,TNBS+EtOH组成纤维细胞的增殖与活化较Control组和EtOH组增强,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Vimentin及a-SMA合成与分泌增加；TGF-β1/Smad3在Control组仅少量表达,TIMP-1表达甚微或无表达,EtOH组与Control组比较,上述指标表达量有所增加,但无统计差异,这可能与乙醇溶剂轻微损伤肠道黏膜导致的组织修复有关,且Tg与WT小鼠之间也无明显差别,而在TNBS+EtOH组纤维化发生过程中TGF-β1、Smad3、TIMP-1阳性表达增加,阳性表达部位可在肠道组织各层且细胞胞浆与细胞胞膜均有表达,TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组更为明显；③Western blot(?)(?)real-time Q-PCR测定肠道组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1、Vimentin、 α-SMA、TGF-β1、Smad3、表达,结果显示：在WT和Tg小鼠组,TNBS+EtOH组较Control组肠组织中表达明显升高,Control组与EtOH组相比蛋白和mRNA表达无差异；TNBS+EtOH/Tg组较TNBS+EtOH/WT组表达更为明显。结论：TL1A过表达可促进TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠肠成纤维细胞活化、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原合成增强以及TIMP-1表达上调；TGF-β1/Smad3信号通路介导的肠成纤维细胞活化,可能是肠道炎症并发肠纤维化的机制之一。第三部分抗TL1A抗体对小鼠T细胞转移实验性结肠炎相关肠纤维化的影响目的：探讨抗TL1A抗体对T细胞移植结肠炎小鼠肠道炎症及纤维化改变的调节作用。方法：①运用T细胞分选技术分别提取来自建立野生型(wild type, WT)C57BL/6小鼠(?)(?)LCK-CD2-TL1A-GFP转基因小鼠的CD4+CD45RBhigh原始T细胞,向Rag-/-小鼠腹腔内注入,建立T细胞转移结肠炎模型,预防性干预是在注射CD4+CD45RBhighT细胞后第一天开始给予抗TL1A抗体,每周两次,持续6周,抗体剂量为500μg；治疗性干预则是在注射CD4+CD45RBhigh细胞四周后即第29天或体重下降超过10%时给予抗TL1A抗体干预,每周两次,持续4周,抗体剂量为500μg；预防性干预与治疗性干预同期给予同种型免疫球蛋白G(Isotype)作为对照组。实验分组如下：(1) WT-Prevention Isotype组：使用来自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,预防性给予同种型免疫球蛋白G作为对照(Isotype);(2)WT-Prevention Ab组：使用来自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,预防性给予抗TL1A抗体干预(Ab)；(3)Tg-Prevention Isotype组：使用来自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,预防性给予同种型免疫球蛋白G作为对照(Isotype);(4)Tg-Prevention Ab组：使用来自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,预防性给予抗TL1A抗体干预(Ab);(5)WT-Treatment Isotype组：使用来自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,治疗性给予同种型免疫球蛋白G作为对照(Isotype);(6)WT-Treatment Ab组：使用来自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,治疗性给予抗TL1A抗体干预(Ab)；(7)Tg-Treatment Isotype组：使用来自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/-小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,治疗性给予同种型免疫球蛋白G作为对照抗体(Isotype);(8) Tg-Treatment Ab组：使用来自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT细胞注射Rag-/小鼠建立T细胞转移结肠炎模型,治疗性给予抗TL1A抗体干预(Ab)；②结肠组织切片经Haematoxylin&eosin staining(H&E染色)观察肠黏膜炎症,Masson’s trichrome staining(MT染色)及天狼猩红染色观察肠纤维化程度并行病理评分；③免疫组织化学方法检测结肠组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA和TGF-β1/Smad3蛋白表达。结果：①采用H&E染色、MT染色及天狼猩红染色结果证明T细胞移植方法建立了实验性小鼠结肠炎相关肠道纤维化模型。Tg-Prevention Isotype组与WT-Prevention Isotype相比较,Tg-Treatment Isotype组与WT-Treatment Iostype组相比较,Tg小鼠肠道腺体结构破坏明显,黏膜下层出现明显炎症细胞侵润,胶原沉积明显增加,炎症及纤维化病理评分升高；使用抗TL1A抗体进行预防性和治疗性干预发现,WT-Prevention Ab组与WT-Prevention Isotype组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Prevention Isotype组比较、WT-Treatment Ab组与WT-Treatment Isotype组比较,Tg-Treatment Ab组与Tg-Treatment Isotype组比较、WT-Prevention Ab组与WT-Treatment Ab组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Treatment Ab组比较,抗TL1A抗体干预后肠黏膜损伤与胶原沉积减轻,病理评分降低,预防性干预较治疗性干预降低病理评分效果更明显；WT-Prevention Isotype组与WT-Treatment Isotype组比较、Tg-Prevention Isotype组与Tg-Treatment Isotype组比较,肠道炎症与纤维化改变无差异。②免疫组织化学检测肠组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原和TIMP-1结果显示：Tg-Prevention Isotype组与WT-Prevention Isotype组相比较,Tg-Treatment Isotype组与WT-Treatment Iostype组相比较,Tg小鼠结肠组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原和TIMP-1阳性面积比值升高；WT-Prevention Ab组与WT-Prevention Isotype组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Prevention Isotype组比较、WT-Treatment Ab组与WT-Treatment Isotype组比较,Tg-Treatment Ab组与Tg-Treatment Isotype组比较、WT-Prevention Ab组与WT-Treatment Ab组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Treatment Ab组比较,抗TL1A抗体干预之后Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原、TIMP-1阳性面积比值降低；WT-Prevention Isotype组与WT-Treatment Isotype组比较、Tg-Prevention Isotype组与Tg-Treatment Isotype组比较,阳性面积比值无明显差异。③免疫组织化学检测肠组织中Vimentin和a-SMA表达,结果显示：Tg-Prevention Isotype组与WT-Prevention Isotype组相比较,Tg-Treatment Isotype组与WT-TreatmentIostype组相比较,Tg小鼠结肠组织中Vimentin及a-SMA阳性面积比值升高；WT-Prevention Ab组与WT-Prevention Isotype组比较、Tg-PreventionAb组与Tg-Prevention Isotype组比较、WT-Treatment Ab组与WT-Treatment Isotype组比较,Tg-Treatment Ab组与Tg-Treatment Isotype组比较、WT-Prevention Ab组与WT-Treatment Ab组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Treatment Ab组比较,抗TL1A抗体干预之后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Vimentin及α-SMA阳性面积比值降低,预防效果更明显；WT-Prevention Isotype组与WT-Treatment Isotype组比较、Tg-Prevention Isotype组与Tg-Treatment Isotype组比较,阳性面积比值无明显差异；④免疫组织化学检测肠组织中TGF-β1Smad3结果显示：Tg-Prevention Isotype组与WT-Prevention Isotype组相比较,Tg-Treatment Isotype组与WT-Treatment Iostype组相比较,Tg小鼠结肠组织中TGF-β1Smad3阳性面积比值升高；WT-Prevention Ab组与WT-Prevention Isotype组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Prevention Isotype组比较、WT-Treatment Ab组与WT-Treatment Isotype组比较,Tg-Treatment Ab组与Tg-Treatment Isotype组比较、WT-Prevention Ab组与WT-Treatment Ab组比较、Tg-Prevention Ab组与Tg-Treatment Ab组比较,抗TL1A抗体干预之后TGF-β1Smad3阳性面积比值降低；WT-Prevention Isotype组与WT-Treatment Isotype组比较、Tg-Prevention Isotype组与Tg-Treatment Isotype组比较,阳性面积比值无明显差异。结论：抗TL1A抗体可减轻TL1A介导的结肠炎相关肠纤维化,预防性干预效果优于治疗性干预,其机制可能与抑制肠成纤维细胞活化、下调TGF-β1/Smad3信号通路有关。