第一部分生物信息学和免疫组化分析线粒体DNA编码基因在结直肠癌组织和正常组织中的表达目的:目前已证实线粒体DNA(mtDNA)拷贝数在结直肠癌组织中存在异常,但结直肠癌组织中mtDNA拷贝数升高还是降低存在争议。此部分实验目的是为了检测结直肠癌组织中mtDNA拷贝数变化情况。方法:TCGA可视化数据库GEPIA和免疫组化分析mtDNA编码基因在结直肠癌组织和正常组织中的表达水平,以此判断结直肠癌组织中mtDNA拷贝数变化情况。结果:GEPIA数据库分析了 mtDNA编码的部分基因在结直肠癌和正常组织间的表达,发现相比于正常组织,MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-CO1、MT-C02、MT-C03、MT-ATP6和MT-ATP8在结直肠癌中低表达,且差别具有统计学意义。免疫组化提示结直肠癌组织中MT-CO1编码蛋白表达下降。结论:GEPIA数据库和免疫组化结果均提示结直肠癌组织中mtDNA拷贝数降低。第二部分构建正常结肠上皮细胞NCM460线粒体DNA部分缺失细胞模型并检测其对NCM460细胞生物学行为的影响目的:相比正常组织,结直肠癌中存在线粒体DNA(mtDNA)拷贝数改变,异常的mtDNA在结直肠上皮细胞恶性转化中的作用还不清楚。本实验建立人正常结肠上皮细胞NCM460 mtDNA部分缺失模型,探讨mtDNA部分缺失是否导致结肠上皮细胞恶性转化,并探索其中可能的机制,为临床上结直肠癌的治疗提供新的思路。方法:用含有微量溴化乙锭(EB)的特殊培养液长期培养NCM460细胞(parentNCM460),成功构建mtDNA部分缺失NCM460细胞模型,命名为mtDNA-reduced NCM460。将 mtDNA-reduced NCM460 细胞在不含 EB 的培养液培养得到mtDNA拷贝数恢复的细胞,命名为mtDNA-revertedNCM460。CCK-8检测三组细胞生长速率;DCFH-DA氧化敏感荧光探针检测三组细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生;JC-1荧光探针检测三组细胞线粒体膜电位的变化;葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测三组细胞内葡萄糖含量和细胞外乳酸分泌量;糖酵解关键酶己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶检测试剂盒检测三组细胞酶活性;ATP检测试剂盒检测三组细胞内ATP水平;RT-PCR检测三组细胞葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4的mRNA表达水平;polyHEMA检测三组细胞是否存在失巢凋亡;transwell检测三组细胞迁移侵袭能力;Western blotting检测三组细胞PI3K/AKT/mTOR的表达水平;检测抑制PI3K/AKT通路后对三组细胞细胞内葡萄糖含量、失巢凋亡和侵袭的影响。结果:成功构建 mtDNA-reduced NCM460 和 reverted NCM460 细胞模型。mtDNA-reduced细胞相比亲本和reverted细胞生长明显变缓。mtDNA-reduced NCM460细胞较亲本和reverted细胞ROS产生和线粒体膜电位明显下降。mtDNA-reduced NCM460细胞内葡萄糖含量较亲本细胞明显增加,P<0.05,revertedNCM460细胞与亲本细胞细胞内葡萄糖含量无明显差别。mtDNA-reduced NCM460细胞乳酸产量较亲本细胞明显增加,P<0.05,reverted NCM460细胞与亲本细胞乳酸产量无明显差别。mtDNA-reduced NCM460细胞己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶活性较亲本细胞明显增加,P<0.05,reverted NCM460细胞己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶活性呈恢复趋势。mtDNA部分缺失对NCM460细胞ATP水平无明显影响。相比亲本和reverted细胞,mtDNA-reduced NCM460细胞抵抗失巢凋亡,且侵袭能力增强。mtDNA-reduced NCM460细胞PI3K p110a,p-Akt,p-mTOR蛋白表达水平明显高于亲本和reverted细胞,抑制PI3K/AKT/mTOR通路后mtDNA-reduced NCM460细胞细胞内葡萄糖含量轻微降低,不再抵抗失巢凋亡,且细胞侵袭能力减弱。结论:长期微量EB诱导培养可成功建立mtDNA部分缺失的NCM460细胞模型。mtDNA部分缺失使NCM460细胞发生有氧糖酵解的代谢表型转换,抵抗失巢凋亡,且侵袭能力增强。这些表型改变可能与PI3K/Akt/mTOR通路被激活有关,恢复 mtDNA 或抑制 PI3K/Akt/nTOR 通路后 mtDNA-reduced NCM460 细胞不再抵抗失巢凋亡,细胞侵袭能力减弱。mtDNA拷贝数下降可以使结肠上皮细胞发生恶性转化。第三部分构建结肠癌细胞SW480线粒体DNA部分缺失细胞模型并检测其对SW480细胞生物学行为的影响目的:在许多肿瘤包括结直肠癌中都发现存在线粒体DNA(mtDNA)异常,异常的mtDNA会导致线粒体功能障碍并已报道与肿瘤恶性生物学行为密切相关,目前异常的mtDNA在结直肠癌中的作用还不清楚。本实验建立人结肠癌细胞SW480 mtDNA部分缺失模型,研究mtDNA部分缺失对SW480细胞生物学行为的影响,并探索其中可能存在的机制,为临床上结直肠癌的治疗提供新的思路。方法:用含有微量溴化乙锭(EB)的特殊培养液长期培养SW480细胞(parent SW480),成功建立mtDNA部分缺失SW480细胞模型,命名为mtDNA-reduced SW480。将mtDNA-reduced SW480细胞在不含EB的培养液继续培养三周左右,得到mtDNA拷贝数恢复的细胞,命名为mtDNA-reverted SW480。采用透射电镜观察以上三组细胞线粒体的超微结构;CCK-8检测三组细胞生长速率;DCFH-DA氧化敏感荧光探针检测三组细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生;JC-1荧光探针检测三组细胞线粒体膜电位的变化;葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测三组细胞内葡萄糖含量和细胞外乳酸分泌量;糖酵解关键酶己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶检测试剂盒检测三组细胞酶活性;ATP检测试剂盒检测三组细胞内ATP水平;RT-PCR检测三组细胞葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4的mRNA表达水平;CCK-8检测5-Fu和奥沙利铂对三组细胞的毒性;流式细胞仪检测5-Fu和奥沙利铂处理三组细胞后的凋亡率;transwell侵袭实验检测三组细胞的侵袭能力;Western blotting检测三组细胞PI3K/AKT/mTOR的表达水平;抑制PI3K/AKT通路后对mtDNA-reduced SW480细胞内葡萄糖含量、凋亡抵抗和侵袭能力的影响。结果:成功构建 mtDNA-reduced SW480 和 mtDNA-reverted SW480 细胞模型。三组细胞生长速率无明显差异。透射电镜观察mtDNA-reduced细胞线粒体变圆,膜结构消失,嵴结构消失或呈无序排列。mtDNA-reduced SW480细胞ROS产生和线粒体膜电位较亲本细胞明显下降,mtDNA-reverted SW480细胞ROS产生增加和线粒体膜电位恢复正常。mtDNA-reduced SW480细胞内葡萄糖含量较亲本细胞明显增加,P<0.05,mtDNA-reverted SW480细胞与亲本细胞细胞内葡萄糖含量无明显差别。mtDNA-reduced SW480细胞乳酸产量较亲本细胞明显增加,P<0.05,mtDNA-reverted SW480细胞与亲本细胞乳酸产量无明显差别。mtDNA-reduced SW480细胞己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶活性较亲本细胞明显增加,P<0.05,mtDNA-revertedSW480细胞己糖激酶和果糖-6-磷酸激酶活性呈下降趋势。5-Fu和奥沙利铂处理三组细胞24小时,IC50分别为52.87±1.41 μg/ml、106.43±6.57μg/ml和78.42±9.10μg/ml,同时适当浓度5-Fu和奥沙利铂处理细胞后,流式检测mtDNA-reduced SW480细胞存在明显药物诱导的凋亡抵抗。相比亲本和reverted细胞,mtDNA-reduced SW480细胞表现出上皮间质转化和侵袭能力增强,PI3K p110α、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显高于亲本和mtDNA-reverted 细胞,抑制 PI3K/AKT/mTOR 通路后 mtDNA-reduced SW480 细胞细胞内葡萄糖含量降低、恢复对化疗药物的敏感性,侵袭能力减弱。结论:长期微量EB诱导培养可成功建立mtDNA部分缺失的SW480细胞模型。mtDNA部分缺失使SW480细胞发生有氧糖酵解的代谢表型转换和上皮间质转化,并表现出对5-Fu、奥沙利铂等化疗药物可逆的凋亡抵抗,mtDNA部分缺失激活PI3K/Akt/mTOR通路,恢复mtDNA或抑制PI3K/AKT/mTOR通路后mtDNA-reduced SW480细胞细胞内葡萄糖含量降低、恢复对化疗药物的敏感性,侵袭能力减弱。