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目的自身免疫性葡萄膜炎是一种常见的致盲性眼病,也是常见的自身免疫性疾病,其发病机制尚未完全阐明。经典wnt信号通路参与生命活动的诸多进程,在多种自身免疫性疾病中发挥着重要作用。百日咳毒素（Pertussis toxin,PTX）是建立小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental autoimmune uveitis,EAU）模型常用的佐剂,可与细胞膜表面PTX敏感的G蛋白结合抑制G蛋白活性。而G蛋白的激活促进低密度脂蛋白受体相关蛋白6（lipoprotein receptor-related protein 6,LRP6）的磷酸化和经典wnt信号通路的激活。因此,本研究将通过小鼠EAU动物模型,研究PTX在EAU发病过程中对wnt通路的作用和对T细胞功能的影响,为阐述EAU的发病机制提供新的思路,进而为葡萄膜炎的预防和治疗奠定理论基础。方法1、构建EAU小鼠动物模型:光感受器间维生素A类结合蛋白651-670(Interphotoreceptor vitamin A binding protein 651-670,IRBP651-670)和完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）皮下注射联合PTX腹腔注射C57BL/6J小鼠建立模型。2、临床观察:免疫后第10天开始每天用眼底镜观察眼底损伤情况并记录评分。3、视网膜组织病理学评分:免疫后第12、16、20、24、28天处死小鼠摘取小鼠眼球,进行苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色,在显微镜下观察视网膜变化并记录评分。4、OCT扫描:免疫后第10天开始,每隔一天用OCT仪扫描眼底视网膜图像,观察视网膜变化。5、实时荧光定量PCR（qPCR）:取免疫前及免疫后第1、5、12、18、25天的脾脏组织,提取m RNA进行逆转录,再检测APC、SOX9、AXIN2、LEF1、TCF1基因的表达情况。6、Western Blot:取免疫前及免疫后第1、2、3、4、5天的脾脏组织,提取蛋白质,检测β-catenin、activeβ-catenin的表达水平。7、流式细胞仪检测:制备免疫前及免疫后第3天脾脏组织的单细胞悬液,检测脾脏单细胞悬液中T淋巴细胞、B淋巴细胞以及DC细胞中activeβ-catenin的表达水平。8、流式细胞仪检测:制备免疫前及免疫后第3天脾脏组织的单细胞悬液,检测Th1细胞和Th17细胞的比例。9、单独或联合使用免疫用药物处理小鼠:根据药物的使用特性和要求,将IRBP、CFA、PTX分为六种使用情况:（1）IRBP-CFA-PTX-;（2）IRBP+CFA+PTX+;（3）IRBP+CFA+PTX-;（4）IRBP-CFA+PTX+;（5）IRBP-CFA+PTX-;（6）IRBP-CFA-PTX+;给药方式给药剂量给药时间不变,按上述分别给药,在给药后第1天和给药后第3天分别处死小鼠,取小鼠脾脏组织,提取蛋白质,检测β-catenin、active-β-catenin的表达水平。10、分选脾脏组织CD4+T细胞:取野生型小鼠的脾脏组织,经研磨、裂红、过膜后得到单细胞悬液,按CD4+T细胞分选试剂盒进行孵抗体、孵磁珠、过磁极处理得到CD4+T细胞。11、脾脏T细胞经典wnt信号表达水平检测:提前一天在96孔板中铺板CD3抗体,然后分选野生型小鼠脾脏CD4+T细胞,洗掉CD3抗体并铺上CD28抗体,将CD4+T细胞种在96孔板中,种板的细胞分为PTX组和对照组,培养后第3天收细胞检测CD4+active-β-catenin+细胞的比例。12、羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE）法检测T细胞增殖水平:分选野生型小鼠脾脏CD4+T细胞,用CFSE进行染色,将标记后的CD4+T细胞种在96孔板中,在PTX的干预下进行增殖实验,增殖后第5天检测T细胞增殖水平。13、T细胞分化检测:分选野生型小鼠脾脏CD4+T细胞,将细胞种在96孔板中,在PTX的干预下进行T细胞分化实验,分别加分化刺激因子IL-12、anti-IL-4向Th1细胞分化,加IL-6、anti-IL-4、TGF-β、IFN-γ向Th17细胞分化,应用流式细胞仪分别检测CD4+IFN-γ+细胞和CD4+IL-17+细胞的比例。结果1、临床观察和组织病理学观察显示,成功建立稳定的EAU小鼠模型。2、Western Blot和qPCR实验显示,EAU疾病早期,脾脏组织经典wnt信号通路表达水平显著下调（p<0.05）,且从免疫后第3天开始。3、流式细胞仪分析显示,免疫后第3天,脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的经典wnt信号通路表达水平明显降低（p<0.05）,脾脏DC细胞的经典wnt信号通路表达水平无明显变化。4.流式细胞仪显示,EAU早期小鼠脾脏中Th1细胞比例较Th17细胞比例高。5、Western Blot实验显示,腹腔注射PTX导致脾脏经典wnt信号表达水平下调。6、流式细胞术显示,PTX处理后T细胞的经典wnt信号表达水平下调。7、T细胞增殖实验显示,PTX处理后脾脏T细胞的增殖水平没有明显变化。8、T细胞分化实验显示,PTX处理后Th17细胞的分化水平没有明显变化,Th1细胞的分化水平明显上调（p<0.05）。结论1、经典wnt信号在EAU小鼠脾脏中处于低表达状态。2、在EAU中,PTX通过抑制脾脏的Gi蛋白活化水平来抑制经典wnt通路。3、在EAU疾病中,PTX可通过抑制脾脏经典wnt通路促进Th1细胞的分化来加强自身免疫性反应,为EAU的发生机制提供了新思路。