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背景:蚊媒病是危害人类健康的重要传染病,如疟疾、登革热等。化学防治为蚊媒控制策略中的主要措施,然而长期、大量杀虫剂的使用导致杀虫剂抗性产生,已严重威胁到杀虫剂的有效性。抗药性已成为当前蚊媒病防治的一大障碍。昆虫表皮是阻止杀虫剂进入体内的第一道屏障,由几丁质和表皮蛋白共同构成。表皮抗性即昆虫表皮变化导致杀虫剂的穿透效率降低。表皮参与抗性的分子机制尚未见深入报道。探索表皮抗性的分子机制有利于制定合理的杀虫剂抗性管理策略。方法:本实验室前期通过转录组测序和蛋白质组分析共同发现,部分表皮蛋白在抗性品系蚊与敏感品系蚊中表达具有差异,其中表皮蛋白基因CPLCG5在抗性品系中高表达。在此基础上,本研究通过实时定量PCR方法,比较表皮蛋白基因CPLCG5在抗敏品系之间的表达差异,通过飞行质谱鉴定表皮蛋白CPLCG5。通过western blot分析表皮蛋白CPLCG5在抗性品系与敏感品系蚊之间的表达差异。通过免疫荧光分析表皮蛋白CPLCG5在蚊体内解剖定位。通过基因微注射敲低表皮蛋白CPLCG5的表达,并采用CDC bottle检测CPLCG5敲低对蚊抗性的影响。并采用透射电镜与免疫电镜研究表皮蛋白CPLCG5敲低后表皮发生的改变,统计学分析表皮蛋白CPLCG5敲低后表皮厚度改变。结果:与敏感蚊相比,CPLCG5基因在抗性蚊中转录水平升高了 8倍,表明CPLCG5基因可能与蚊抗性相关。基因CPLCG5时空表达分析发现,基因CPLCG5在蚊刚刚化蛹时(白蛹)和羽化后第一天表达剧烈的升高,随后逐渐降低,羽化3天后表达趋于平稳,提示白蛹与羽化后第一天可能为表皮组装发育期,羽化3天后成蚊表皮基本发育成熟。CPLCG5基因编码表皮蛋白CPLCG5,其推测分子量大小约为12KD。采用实验室制备的CPLCG5-抗体,荧光定位分析发现表皮蛋白CPLCG5主要定位于蚊足与蚊翅,提示表皮蛋白CPLCG5具有组织特异性。Western blot发现表皮蛋白CPLCG5在抗性品系蚊足中的表达约为敏感品系蚊足中的2.2倍。为进一步研究基因CPLCG5的功能,成蚊siRNA微注射实验后,si-CPLCG5干扰组CPLCG5的表达约是si-NC组的22.7%,表明siRNA基因干扰后显著降低了 CPLCG5基因表达量。随后CDC bottle实验发现,CPLCG5敲低显著提高蚊对溴氰菊酯的敏感性,提示CPLCG5在杀虫剂抗药性中发挥着重要的作用。我们同时采用透射电镜与免疫电镜观察CPLCG5敲低成蚊中表皮蛋白的改变。透射电镜结果显示,表皮蛋白CPLCG5敲低后出现表皮几丁质层排列混乱、分层消失,提示表皮蛋白CPLCG5具有维持几丁质层稳定的作用。免疫电镜比较CPLCG5敲低组与对照组发现,siNC对照组全表皮厚度为1.721±0.22lμm,而siCPLCG5实验组全表皮厚度为1.385±0.121μm,其中对照组外表皮厚度为0.946±0.126μm,而siCPLCG5实验组外表皮厚度为0.716±0.110μm,表明CPLCG5敲低导致蚊全表皮,尤其是外表皮厚度改变。提示表皮蛋白CPLCG5存在对于维持昆虫表皮的结构非常重要,CPLCG5表达量增加有利于形成更厚、更坚固的表皮,导致昆虫产生抗性。结论:本次工作首次对表皮抗性分子机制进行深入研究,以上研究结果支持表皮蛋白CPLCG5表达上升使表皮形成更加坚固的表皮蛋白基质导致昆虫产生杀虫剂表皮抗性。