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天然红心蛋产自湖区蛋鸭，其蛋黄光泽红艳，红色色度可达RYCF(Roche Yolk Color Fan)值15以上，在国内外市场上深受消费者喜爱。天然红心蛋的生产与湖区蛋鸭摄食一种季节性生长的天然水生植物——菹草(Potamogeton crispus L．)有重要关系。根据本实验室研究发现，这种类胡萝卜素不仅赋予蛋黄艳丽的红色，而且还具有非常特殊的抗癌活性，因此天然红心蛋红色类胡萝卜素及其原产资源的研究具有重要的学术意义和应用前景。目前有关天然红心蛋中红色类胡萝卜素的组成、结构、性质和生物来源及其抗癌活性评价等系列研究均未见报道。 本论文首次采用色谱、HPLC／MS／MS及高分辨质谱等现代仪器手段对天然红心蛋中红色类胡萝卜素成分及其来源进行了结构分析和鉴定；并采用分子生物学前沿技术从细胞凋亡角度探讨了天然红心蛋中红色类胡萝卜素提取物的抗癌生物活性等。 主要研究内容如下： 1 天然红心蛋红色类胡萝卜素的分离纯化 1．1 总类胡萝卜素的提取 从红心蛋黄冻干粉中提取总类胡萝卜素的最优提取条件： 溶剂：石油醚-丙酮=2∶1(v／v)；料液比：1∶4(w／v)；温度40℃，提取3次，每次60min。 每100克普通干蛋黄粉中含总类胡萝卜素的含量为4.5毫克； 每100克干红心蛋黄粉(色度15度及以上)总类胡萝卜素的含量为9.25毫克。 1．2 天然红心蛋红色类胡萝卜素的分离纯化 材料：总类胡萝卜素提取物。 采用氧化镁(MgO∶硅藻土=1∶2w／w)柱或硅胶柱脱去类胡萝卜素提取物中的脂类成分； 在制备硅胶薄层色谱上，采用展层剂A(石油醚-丙酮=17：4 v／v)或展层剂B天然红心蛋中红色类胡萝卜素的结构表征及其生物活性评价(石油醚一丙酮一甲醉二8:2:1 v/v/v),可从柱层析脱脂类胡萝卜素部分分离出一条红色素色谱带R; 采用展层剂C(正己烷一乙酸乙酷一丙酮一甲醇二27:4:2:2 v/v/v/v),可从柱层析脱脂色素部分分离出三条红色素色谱带R1、R2、R3。 将展开的红色谱带R和R1、R2、R3部分,用石油醚一丙酮(2:1 v/v)洗脱,进一步分离制备得到各个红色素色谱带的分离纯化组分即红色类胡萝卜素R和红色类胡萝卜素RI、RZ、R3组分。1 .3类胡萝卜素提取物的稳定性 天然红心鸭蛋类胡萝卜素提取物在避光、惰性气体及80℃以下的温度条件下是稳定的,但在处理条件下容易发生顺反异构化作用(trans一ci 5 isomerism);对金属离子K’、Na‘、Ca”、Mg++、Cu++、Zn++、Fe+++、Al+++不稳定;对二价铁离子Fe++、光线等极不稳定;常用抗氧化剂VC、VE、BHT等对总类胡萝卜素提取物有很好的保护作用。2天然红心蛋红色类胡萝卜素R的初步鉴定 通过定性化学分类反应表明红色素R为多烯类色素,分子中不存在环氧结构。皂化前后红色素在薄层上的位置及最大吸光值没有变化,表明红色物质不存在酷键结构部分。 红外光谱特性表明红色素R为含有拨基,不含轻基的类胡萝卜素。 UV一VIS及与硼氢化钠反应特性表明,红色类胡萝卜素R分子中存在与双键共扼的拨基。3天然红心蛋红色类胡萝I、素Rl,RZ,R3组分的HPLO-MS一MS鉴定及顺反异构体的发现 红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分具有与红色类胡萝卜素R相同的化学反应特性。 RAD扫描光谱结果显示:红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分分子中均存在与双键呈共辘状态的拨基。红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分的HPLC一MS一MS鉴定结果表明这三者均是分子量为562的类胡萝卜素,它们均存在顺反异构现象,在存放过程中这三者可互相转变,最后以动态平衡方式存在。刘良忠华中农业大学20()4届博士学位论文4天然红心蛋红色类胡萝卜素的生物来源分析及HPLC一MS一Ms鉴定 天然红心蛋红色类胡萝卜素R与范草红色类胡萝卜素、紫杉紫素的HPLc有很好的对应关系。三种来源的红色类胡萝卜素具有相同的与硼氢化钠反应性质。采用Agilent 1100series LC/M SD Trap设备,5腼,25emX4.6nnn,ODSC,。色谱柱,18℃柱温,0.smL/min流速,进样量5协L,甲醇一梅ter(99.5:0.5 v/v)为流动相,检测波长480njrn,天然红心蛋红色类胡萝卜素R、范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素在该条件下都被分成五个峰,且三种来源的红色类胡萝卜素的各个峰之间具有很好的对应关系。一级质谱结果表明:天然红心蛋红色类胡萝卜素R、殖草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的分子量,都为562。二级质谱结果表明,三个来源的红色类胡萝卜素的液相色谱的对应峰具有基本相同的二级质谱,都有几个主要的碎片而z峰,包括545[M+H一15]+,507[M+H一56]+,479[M干H一54]+,425[M+H·1 35]+,373[M+H一190〕+,359[M艰一204]+,347[M爪·216〕’等.表明天然红心蛋红色类胡萝 卜素、范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的组成和基本结构。5天然红心蛋红色类胡萝卜素R与殖草红色类胡萝卜素的高分辨质谱分析 天然红心蛋红色类胡萝卜素R和范草红色类胡萝卜素的高分辨质谱分析得出最可能的组成分子式为C4oHS。仇,计算分子量为562.38108。进一步确证了天然红心蛋红色类胡萝卜素R和范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的组成。二级质谱碎片模拟裂解分析符合紫杉紫素的裂解规律。 结果表?