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微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度在19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子,通过与靶基因mRNA 3’端非翻译序列互补结合从而使靶mRNA降解或翻译受抑制,负向调控靶基因的表达。研究发现,miRNA在不同的肿瘤微环境中可以作为癌基因抑或抑癌基因发挥重要作用。此外,本课题组研究发现,人体血清中存在大量含量丰富稳定表达的miRNAs。此后研究发现血清miRNA可以作为食管癌,肺癌,胃癌,肝癌以及胰腺癌等恶性肿瘤的生物标志物,提示其作为标志物的巨大潜力。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是目前全球第三大恶性肿瘤,其发病机制尚未完全阐明,并且在临床诊断及治疗中仍存在许多尚未解决的问题。在课题组前期研究的基础上,针对目前临床上不同期别结直肠癌尚未解决的关键问题,进一步对循环mi RNA作为结直肠癌分子标志物开展了一系列的实验和临床研究,并且初步探讨相关mi RNA参与结直肠癌发生发展的机制。论文第一部分开展了循环miRNA作为非转移性结直肠癌分子标志物的实验和临床研究。首先,运用高通量低密度芯片(Taqman Low density array,TLDA)测序技术发现有21种血清miRNAs在手术前(20例),手术后(20例)患者及正常对照(20例)分别组成的混合血清之间具有较大差异;接着,运用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)对初筛的所有miRNAs进行单个样本的复筛(包括手术前患者血清样本20例,配对的手术后血清样本20例,正常对照20例)和两个中心的独立验证:包括内部验证集(包括手术前患者血清样本65例,配对的手术后血清样本65例,正常对照样本40例)和独立验证集(包括手术前患者血清样本90例,配对的手术后血清样本90例,正常对照样本70例)。结果显示miR-17-3p和miR-106a表达量在CRC患者中升高,在术后降至正常人水平,而miR-145的表达量在结直肠癌患者中升高,在术后恢复至正常水平,可以作为结直肠癌诊断及疾病动态监测的新型标志物。对所有入组患者预后进行生存分析发现高水平miR-17-3p和miR-106a与肿瘤复发具有显著相关性,可以作为预后预测的新型分子标志物。论文第二部分开展了寻找有效预测两种转移性结直肠癌(metastatic CRC,mCRC)化疗方案(包括FOLFOX方案和FOLFIRI方案)敏感性的血清miRNA表达谱。首先,我们开展了血清miRNA作为转移性结直肠癌FOLFOX疗效预测标志物的实验和临床研究。运用tlda初筛由12例对folfox方案敏感患者与12例对folfox方案不敏感患者分别组成的化疗前混合血清中差异表达的mirnas,发现30种mirna在敏感组与不敏感组之间具有较大差异;rt-qpcr对初筛mirnas在单样本中进行复筛,mir-135b和mir-208b的表达水平与初筛结果一致,在化疗不敏感组显著上升;随后,我们又利用这两个mirnas对92例包含57例敏感患者及35例不敏感患者的进行验证,结果显示,血清中mir-135b和mir-208b的表达水平在化疗不敏感患者中显著上调,roc曲线显示诊断的准确率分别为87.7%和77.1%;对两种mirnas在化疗前后(48例敏感患者及24例不敏感患者)表达量进行了检测,发现在化疗不敏感组患者中,mir-135b和mir-208b的水平治疗后进一步升高,而在敏感组患者中,两者水平在治疗后下降。此外,对所有入组患者进行治疗后生存随访发现,血清中高表达mir-135b和mir-208b预示更差的预后,肿瘤更快进展。同时,我们以同样的思路开展了血清mirna作为mcrc患者folfiri方案疗效预测标志物的实验和临床研究。运用tlda初筛,发现32种mirna在敏感组与不敏感组之间具有较大差异;rt-qpcr技术对初筛mirnas进行复筛,发现mir-135b,mir-10a和mir-627的表达水平与初筛结果一致,即在化疗不敏感组显著上升,roc曲线显示诊断的准确率分别为84.0%,78.9%和79.0%;对上述三种mirnas在化疗前后(16例敏感患者及13例不敏感患者)表达量进行了检测,发现三者表达水平在不敏感组患者中治疗后进一步升高,在敏感组患者中治疗后下降。论文第三部分探索了mir-135b通过下调抑癌基因tgfbr2促进结直肠癌发生发展的机制。发现tgfbr2在结肠癌组织表达下调,而其mrna的水平较正常癌旁组织未无显著变化。生物信息学预测mir-135b可与tgfbr23’utr结合,结合位点在各物种中保守,且mir-135b在结直肠癌组织中的水平较正常癌旁组织显著上调。接着通过对两种结肠癌细胞系对两者关系进行验证。通过荧光素酶报告实验证实mir-135b与tgfbr2可直接结合。细胞中过表达或者特异性降低mir-135b的表达水平,westernblot实验证实mir-135b通过特异性的与tgfbr2转录本的3’-utr结合调控tgfbr2的表达。细胞功能实验发现转染mir-135bmimics后细胞增殖活性较对照组升高,细胞凋亡率较对照组下降;而转染mir-135bbinhibitors组细胞增殖则下降,细胞凋亡率显著增加。因此,miR-135b可通过降低TGFBR2水平促进结直肠癌细胞系的增殖及抑制其凋亡。提示miR-135b通过下调TGFBR2促进结直肠癌发生发展。综上所述,本论文对血清中miRNA表达谱进行了检测和分析,开展了血清miRNAs作为结直肠癌标志物的临床和实验研究,发现:(1)血清中mi R-106a,和miR-17-3p在Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者中显著上调,并在手术后恢复正常水平,可以作为结直肠癌疾病诊断及动态监测标志物。此外,高水平的miR-106a及miR-17-3p与术后复发显著相关,可以作为结直肠癌疾病预后标志物。(2)miR-135b和miR-208b在对FOLFOX方案耐药的患者血清中显著上调,可以作为mCRC患者FOLFOX方案化疗疗效预测标志物。(3)miR-135b,miR-10a和miR-627在对FOLFIRI方案耐药的患者血清中显著上调,可以作为FOLFIRI化疗疗效预测标志物。(4)miR-135b可通过对抑癌基因TGFBR2的调控促进CRC的发生发展。