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目的:以有机溶剂乙醇回流提取中药皂角刺中的总黄酮成分,并上聚酰胺柱进行纯化,得到两批含量不同的总黄酮样品。以CCK-8法测定皂角刺总黄酮粗提物及纯化后对体外四种肿瘤细胞增殖作用的影响,旨在为课题后期皂角刺总黄酮的进一步分离及制备单体的研究提供科学的实验依据。
方法:在前期实验研究的基础上,以最佳的提取工艺条件回流提取皂角刺中的黄酮类组分,然后对皂角刺总黄酮粗提物的纯化进行研究,得出最佳精制条件。根据颜色反应及紫外光谱定性产品中黄酮类化合物具有黄酮的吸收光谱特征,可以确定产品可能属黄酮类。对粗提取物和纯化后的皂角刺总黄酮进行紫外-可见分光光度法含量测定。最后分别选用K562人白血病细胞株,Bel-7402人肝癌细胞株,SMMC-7721人肝癌细胞株,HCT116人结肠癌细胞株,体外培养于含10％胎牛血清的RPM11640培养基,置于37℃、5％CO2培养箱中。取对数生长期的细胞,调整合适的细胞悬液密度,分别接种于96孔培养板,用不同浓度(250、125、62.5、31.25、15.625)μg·mL-1的皂角刺总黄酮粗提物及纯化后分别处理48小时后,以CCK-8法测定皂角刺总黄酮粗提物及纯化后对体外肿瘤细胞增殖作用的影响,并对2组间数据进行t检验,分析两者是否存在统计学意义。
结果:聚酰胺纯化的最佳条件为:上样浓度1mg·mL-1,上样体积1.5BV,40％的乙醇4.5BV(床体积)洗脱,洗脱流速3BV／h。采用加热回流提取-聚酰胺纯化的工艺路线,此条件下得到的洗脱液通过真空减压干燥,得到黄褐色的总黄酮粉末。紫外-可见分光光度法(比色法)含量测定达到58.84％,经聚酰胺二次吸附、洗脱后,粗制皂角刺总黄酮产品的纯度提高到81.84％,达到较好的纯化效果。以芦丁为标准品,建立了标准曲线的回归方程为y=1.1939x-0.0068,r=0.9999,线性关系在0.053—0.848mg范围内。总黄酮平均回收率为96.7％,RSD为2.02％(n=6)。皂角刺总黄酮对各肿瘤细胞增殖的抑制作用随着浓度的增加而增强,呈现出较好的量效关系。皂角刺总黄酮纯化后(含量81.84％)对K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分别为(30.30±14.30)、(75.30±4.96)、(19.36±1.78)、(42.45±17.57)μg·mL-1。皂角刺总黄酮粗提物(含量58.84％)对K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分别为(106.04±35.59)、(106.85±35.77)、(120.68±16.22)、(68.89±2.30)μg·mL-1,P<0.05,皂角刺总黄酮粗提物及纯化后的抗肿瘤活性差异有统计学意义。
结论:采用加热回流提取-聚酰胺纯化的工艺路线,能够使粗制皂角刺总黄酮产品的纯度从58.84％提高到81.84％,利用紫外-可见分光光度法(比色法)测定皂角刺总黄酮含量,方法简单,且稳定性、精密度均良好。皂角刺总黄酮纯化后的抗肿瘤活性优于粗提物,并且呈现出一定的浓度依赖性,具有较强的体外抗肿瘤活性,这对皂角刺总黄酮的进一步分离及制备单体的研究有重要意义。