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衣原体（Chlamydia）是一类专性细胞内寄生的细菌,二相发育周期使其感染机制独特,引发的各类疾病难以控制。衣原体的发育周期为原体（elementary body,EB）首先吸附细胞并通过细胞吞饮作用进入细胞,宿主细胞包裹EB形成空泡后EB发育为网状体（reticulate body,RB）,后者无感染性但可通过二分裂形式进行繁殖,RB分化为EB后衣原体完成一轮生长发育。鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）属于衣原体属,分布广泛,尤其是家禽家畜自然感染普遍,多以潜伏性感染为主。人类可通过呼吸道-气溶胶、皮肤、粘膜等途径引起感染,轻症类似感冒症状,而重症可出现全身中毒症状,甚至死亡。由于缺乏典型症状和诊断措施,Cps感染在临床上误诊漏诊众多。另外,由于其易传播性以及高致病性,Cps已被列入国际《禁止生物武器公约》中的经典生物战剂和生物恐怖剂。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）也属于衣原体属,人是Ct的唯一宿主,Ct导致的疾病多为自限性疾病,反复感染或长期感染导致的炎症反应可使宿主患不孕、异位妊娠、失明等严重疾病[1]。其中致盲性沙眼和泌尿生殖系统的感染分别是发展中国家和发达国家的一种社会问题。世界卫生组织旨在2020年消灭致盲性沙眼[2],许多国家为了消灭沙眼采取WHO的SAFE策略并取得了显著进步[3],然而十多年后是否完成可持续地消灭沙眼的目标仍是未知数。Cps和Ct分别包含9种和15种omp A基因型,不同型的不同衣原体种存在一定的宿主和组织感染嗜性。由于全基因组测序技术的快速发展,近年来国外报道了很多Cps和Ct基因组测序分析结果,加深了对这两种病原体在不同地区与不同宿主共进化的认识。基因组的比较分析也为发现鉴定衣原体新型毒力基因提供了重要工具。作为一类缺乏研究的病原体,来自国内的Cps或Ct基因组学报道及在此基础上的毒力基因鉴定研究还很有限。1论文第一部分,首次分析了国内Cps羊流产株CG1和眼型Ct分离株QH111L的全基因组序列,这对加深理解Cps和Ct在我国的进化有重要意义。1.1 Cps羊流产株CG1的全基因组序列测定与分析。前期研究发现,我国的Cps CG1流行株可以导致羊流产,Cps C型菌也在我国的牛、猪等哺乳动物和鸭等禽类中被分离到,这与国外Cps C型菌只在水禽类动物中被发现的报道不一致[4]。采用二代测序技术对CG1株进行基因组重测序,比对分析重测序序列结果和国外发表的C型菌GR9株的基因组序列。结果发现,与GR9株相比,CG1的SNP变异位点多数集中于一段约23kb的固定区域（B5980269-B5980288）。将CG1的该区域进行BLAST分析,发现12个开放阅读框均与流产衣原体高度同源,这或许可以用来解释CG1可以感染哺乳动物（羊）,并导致羊流产的原因。除了发现CG1中存在一段流产衣原体的基因序列,在基因组对比分析中我们还发现了CG1的B5980681基因发生了无义突变,该基因编码一个假定的包涵体膜蛋白。1.2眼型Ct分离株QH111L的全基因组测序与分析。QH111L为omp A基因B型,与B/Tunis-864株的omp A序列高度同源,只在LGV、F和G等UGT型菌株的omp A中被发现的密码子改变出现在第91位氨基酸上,说明QH111L的omp A有UGT型特征。染色体全长序列的系统进化发育分析表明,QH111L属于典型的眼型Ct分支,介于B和C型菌的分支之间,但与其它B或C型Ct的遗传距离较远。将QH111L与坦桑尼亚分离株B/TZ1A828的染色体序列进行比对,发现22个ORF存在10个以上SNP差异,其中的9个ORF和12个ORF分别与C型菌和UGT型的同源性最高,说明QH111L的染色体序列具有C型和UGT型特征。Ct的质粒序列高度保守,不同Ct分离株的质粒间仅存在有限的SNP差异。QH111L质粒属于典型的眼型Ct分支,但其编码的pgp2和pgp5基因分别含有一个UGT型SNP位点,这说明QH111L的质粒与染色体存在共进化,与在omp A和染色体序列中发现UGT型特征相一致。2论文第二部分,对衣原体毒力基因（Ct和Cps的CT135同源基因、Cps的B5980681基因等）进行克隆表达,为研究它们的致病机制奠定基础。2.1 Ct和Cps的CT135基因克隆表达。A-K型Ct在传代培养时,CT135基因易发生无义突变,该基因可能与Ct的体外适应性生长有关。在雌鼠生殖道感染模型上,CT135变异与Ct的感染持续时间、致病能力等显著相关[5],但该基因的表达、定位等仍没有报道。一个主要原因是A-K型衣原体在培养时CT135基因易发生无义突变,而在LGV型Ct中CT135基因虽保持完整但很可能无法正常表达。CT135同源基因为衣原体科特异性,在Cps等其它衣原体中该基因不存在自发的无义突变现象。通过重构Cps CT135同源基因（B5980590）的原核表达载体并诱导表达蛋白,切胶纯化方式纯化目的蛋白,免疫小鼠制备血清多抗。对感染CG1的He La229细胞进行甲醇固定,用抗血清作一抗,免疫荧光实验观察蛋白在细胞中的定位。发现B5980590基因编码的蛋白在包涵体膜上浓染,这与已知的Inc A蛋白类似,证实了B5980590基因编码包涵体膜蛋白,但其染色特征与Inc A存在差异,在包涵体上呈现不均匀分布,这可能与其功能有关。采用相同的方法克隆表达Ct CT135基因,多次尝试后发现不能获得重组蛋白,这与Cps CT135同源基因的表达结果不一致。用q PCR技术在E.coli中分析了蛋白未能表达的原因,发现诱导后CT135 m RNA的量出现大幅下降,与m RNA量上调的预期不符。将原核表达载体中CT135基因的起始密码子ATG中的A删除,q PCR实验发现诱导后CT135 m RNA的量大幅提高。这提示,低水平表达的CT135蛋白可能参与调节自身m RNA的稳定性。最后我们发现,在表达载体中CT135的C端融合GST可获得重组蛋白,为制备抗CT135抗体奠定了基础。2.2 Cps B5980681基因的克隆表达。在体外传代培养时,Ct的CT135基因易发生变异。Cps的基因组稳定性缺乏研究,我们上面通过对Cps CG1株的基因组测序分析发现B5980681发生了无义突变,这可能与传代培养相关,因为该基因只是在部分Cps分离株中发生了变异。B5980681同样编码一个假定的科特异性包涵体膜蛋白,目前已完成了该蛋白的重组表达和纯化。总结:对Cps CG1株和Ct QH111L株的基因组学研究对加深理解两种衣原体在我国的适应性进化、对防控两种衣原体病有重大意义,也为深入研究它们的适应性进化机制提供了方向。Cps和Ct CT135同源基因、及Cps B5980681的克隆表达为深入研究它们的功能和致病机理奠定了基础。