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蛋白酶抑制剂是能特异降低靶蛋白酶活力的一类蛋白质或多肽分子,蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶形成特异的蛋白-蛋白复合体,造成竞争性的抑制作用,从而调节植物内源性蛋白酶活力,保护植物免受昆虫和真菌的侵蚀。蛋白酶抑制剂还与动物体内诸多生理生化反应,如血液凝固、肿瘤细胞生长分化、艾滋病病毒的浸染等有密切的关系。这些功能引起了人们对蛋白酶抑制剂的普遍注意与重视。目前已从豆科、葫芦科、十字花科、禾本科和茄科等植物材料中分离得到了丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等三类蛋白酶抑制剂,并有相当多的蛋白酶抑制剂基因被克隆。决明子(Semen Cassiae)为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实,晒干,打下种子,除去杂质。决明子入药最早记载于我国的《神农本草经》,列入120种上药(“为君主养命以应天”)之一,性味甘、苦、咸、微寒、无毒,归肝、肾、大肠经。明代李时珍释其名日:“此马蹄决明也,以明目之功而名。”五代吴越时的《日华子本草》认为“作枕治头风明目,胜于黑豆。”现代临床报道其有降低血清胆固醇,治疗高血脂症、高血压等作用。我们分别从两种决明(Cassia tora和Cassia obtusifolia)的种子中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂CTTI(Cassia tora trypsin inhibitor)和COTI(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor),对它们进行了性质与功能研究。纯化步骤简述如下:小决明(Cassia tora)的干燥成熟种子研磨粉碎后,去离子水抽提两次,55℃热变性除去部分杂蛋白、30—50%饱和度硫酸铵分部盐析等步骤,得到抑制剂粗提物。利用明胶—PAGE和明胶—SDS—PAGE方法分析显示小决明子中含有一种蛋白酶抑制剂,该抑制剂对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均有抑制作用。进一步利用DEAE-Sephadex A50离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析,最后从粗提液中分离纯化得到该蛋白酶抑制剂,命名为CTTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为6.5 kDa。CTTI能形成较强的二聚体,即使在含有SDS的环境中,仍然能够维持二聚体状态。经过纯化,CTTI的纯化倍数达19倍,产率为13%,纯品蛋白质的比活力为317UI/mg蛋白。CTTI在pH2-12的环境中有极强的稳定性,能够保持85%的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高,可以保持近100%抑制活性,在60℃时可以保持82%的抑制活力,当温度继续升高到70℃以上时,其抑制活力迅速下降,表明CTTI具有较高的热稳定性。利用蛋白质内源荧光检测CTTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280 nm时,天然CTTI的最人发射波长为337 nm,是一种典型的含有色氨酸的蛋白质荧光光谱。当CTTI在70℃时加热10分钟后,其荧光峰位置红移至344nm,表明CTTI的构象发生了一定的变化,其分子中的色氨酸残基移向蛋白质分子的表面,变得更为疏水。同时荧光强度也出现一定程度的下降。测定CTTI的远紫外园二色谱,也能反映相似的构象变化。天然CTTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于189 nm,最大吸收负峰位于203 nm,在190 nm处由正吸收值变为负吸收值。CD Pro二级结构软件分析CTTI的二级结构中,含有12.3%α螺旋,30.9%β折叠,20.1%β转角和36.8%无规卷曲。当CTTI被加热变性后,CTTI的远紫外园二色谱发生一定程度的变化。CTTI的β折叠和β转角分别有7.2%和3.7%变为无规卷曲。荧光光谱和园二色谱均表明,当CTTI受到加热后,其分子构象均发生了变化,导致蛋白质变性。大决明(Cassia obtusifolia)的干燥成熟种子研磨粉碎后,去离子水抽提两次,55℃热变性除去部分杂蛋白、35—55%饱和度硫酸铵分部盐析等步骤,得到抑制剂粗提物。利用BAPNA方法确定粗提物具有抑制胰蛋白酶的能力。利用明胶—PAGE和明胶—SDS—PAGE方法分析显示大决明子中含有一种胰蛋白酶抑制剂,进一步利用Trypsin-Sepharose亲和层析和Sephadex G-75分子筛层析,从粗提液中分离纯化得到该胰蛋白酶抑制剂,命名为COTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为20 kDa。COTI在还原与非还原状态下的SDS-PAGE均显示为一条带,表明COTI仅由一条链构成。通过MALDI—TOF测定COTI的精确分子量为19812.55Da。COTI的肽指纹图谱中显示有8个主要的信号峰簇,其中有6个单信号峰和2个双信号峰。利用MASCDOT软件在NCBI上检索,未发现有相似的肽指纹图谱,表明到目前为止,尚未有关大决明胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱报道。COTI在pH2—12的环境中有极强的稳定性,能够保持80%的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高,可以保持近100%抑制活性,但当温度继续升高时,其抑制活力迅速下降,表明CTTI具有较高的热稳定性。COTI在含有二硫苏糖醇的条件下,抑制活性会随时间的推移而逐渐降低。待二硫苏糖醇处理120分钟后,只保留50%的抑制活性,处理12小时后,COTI的抑制活性完全消失。滴定曲线测定COTI抑制胰蛋白酶的表观抑制常数为0.3uM,抑制摩尔比为1:1。胰蛋白酶与COTI的复合物实验也证实胰蛋白酶与COTI能形成1:1的复合物。化学修饰实验表明COTI的活性中心含有赖氨酸残基。在模拟胃酸环境中,COTI能较长时间抵抗胃蛋白酶的水解作用,表明COTI是一种较强的抗营养因子。但是当COTI在受到加热、还原或修饰处理后,COTI会不同程度地失去对胃蛋白酶的抵抗能力,其中还原或修饰处理会导致抗水解能力的完全丧火。进一步利用串联质谱分析肽指纹图谱中的部分信号峰,通过De novoSequencing技术测定了部分信号峰中的氨基酸序列。测定的序列在NCBI上检索,发现它们与许多豆科的Kunitz蛋白酶抑制剂有较高的同源性。因此依据COTI的生物化学性质诸如COTI只由一条多肽链构成,分子量介于18-22kDa范围,只有一个活性中心,对还原剂的不稳定性以及氨基酸一级序列的同源性,我们推测COTI属于Kunitz抑制剂家族。更为重要的是,体外分析酶活性的实验表明,当COTI的浓度为40ug/ml时,能够抑制菜青虫中肠碱性蛋白酶60%的活性,并且COTI的抑制能力与大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂相当。体内喂食实验结果显示,当喂食时间长达6天后,喂食COTI的实验组相对于喂食牛血清白蛋白的对照组,体重减轻30%。此结果表明COTI能够抑制菜青虫的生长,这为进一步开发抗菜青虫的生物试剂奠定了一定的基础。利用蛋白质内源荧光检测COTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280nm时,天然COTI的最大发射波长为313nm,表明COTI的荧光只来自于分子中的酪氨酸残基,而并非来自色氨酸残基。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后,COTI的荧光光谱发生较大的变化。首先313nm的荧光峰的荧光强度减少12%,其次在345nn处新发生一个色氨酸的荧光峰。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后,313nm的荧光峰的荧光强度减少78%。测定COTI的远紫外园二色谱,也能反映相似的构象变化。天然COTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于187nm,最大吸收负峰位于200nm,在190nm处由正吸收值变为负吸收值。CDPro二级结构软件分析COTI的二级结构中,含有4%α螺旋,26.7%β折叠,30.6%β转角和38.2%无规卷曲。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后,COTI的远紫外园二色谱发生较大的变化。COTI的β折叠和α螺旋分别减少了15%和增加了28%。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后,β折叠和α螺旋分别减少了12%和增加了10%。荧光和园二色谱分析表明:二硫键、疏水作用、范德华力、氢键和静电作用在维持COTI高级构象方面起着重要的作用。当COTI受到加热、还原或修饰处理后,抑制活性的下降是由于其构象改变所致。荧光光谱不仅可以分析COTI的构象变化,还可以分析COTI与胰蛋白酶形成的复合物的构象变化。COTI—胰蛋白酶复合物的荧光光谱中荧光峰位于326nm。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后,荧光峰位置红移至343nm,荧光强度减少25%;而当COTI的赖氨酸残基被修饰后,荧光峰位置无变化,荧光强度减少76%。这表明当COTI受到还原或修饰后,COTI与胰蛋白酶无法形成正常的复合物,因而抑制活性下降。