蛋白酶抑制剂是能特异降低靶蛋白酶活力的一类蛋白质或多肽分子，蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶形成特异的蛋白-蛋白复合体，造成竞争性的抑制作用，从而调节植物内源性蛋白酶活力，保护植物免受昆虫和真菌的侵蚀。蛋白酶抑制剂还与动物体内诸多生理生化反应，如血液凝固、肿瘤细胞生长分化、艾滋病病毒的浸染等有密切的关系。这些功能引起了人们对蛋白酶抑制剂的普遍注意与重视。目前已从豆科、葫芦科、十字花科、禾本科和茄科等植物材料中分离得到了丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等三类蛋白酶抑制剂，并有相当多的蛋白酶抑制剂基因被克隆。决明子(Semen Cassiae)为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实，晒干，打下种子，除去杂质。决明子入药最早记载于我国的《神农本草经》，列入120种上药(“为君主养命以应天”)之一，性味甘、苦、咸、微寒、无毒，归肝、肾、大肠经。明代李时珍释其名日：“此马蹄决明也，以明目之功而名。”五代吴越时的《日华子本草》认为“作枕治头风明目，胜于黑豆。”现代临床报道其有降低血清胆固醇，治疗高血脂症、高血压等作用。我们分别从两种决明(Cassia tora和Cassia obtusifolia)的种子中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂CTTI(Cassia tora trypsin inhibitor)和COTI(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor)，对它们进行了性质与功能研究。纯化步骤简述如下：小决明(Cassia tora)的干燥成熟种子研磨粉碎后，去离子水抽提两次，55℃热变性除去部分杂蛋白、30—50％饱和度硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。利用明胶—PAGE和明胶—SDS—PAGE方法分析显示小决明子中含有一种蛋白酶抑制剂，该抑制剂对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均有抑制作用。进一步利用DEAE-Sephadex A50离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析，最后从粗提液中分离纯化得到该蛋白酶抑制剂，命名为CTTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为6.5 kDa。CTTI能形成较强的二聚体，即使在含有SDS的环境中，仍然能够维持二聚体状态。经过纯化，CTTI的纯化倍数达19倍，产率为13％，纯品蛋白质的比活力为317UI／mg蛋白。CTTI在pH2-12的环境中有极强的稳定性，能够保持85％的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高，可以保持近100％抑制活性，在60℃时可以保持82％的抑制活力，当温度继续升高到70℃以上时，其抑制活力迅速下降，表明CTTI具有较高的热稳定性。利用蛋白质内源荧光检测CTTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280 nm时，天然CTTI的最人发射波长为337 nm，是一种典型的含有色氨酸的蛋白质荧光光谱。当CTTI在70℃时加热10分钟后，其荧光峰位置红移至344nm，表明CTTI的构象发生了一定的变化，其分子中的色氨酸残基移向蛋白质分子的表面，变得更为疏水。同时荧光强度也出现一定程度的下降。测定CTTI的远紫外园二色谱，也能反映相似的构象变化。天然CTTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于189 nm，最大吸收负峰位于203 nm，在190 nm处由正吸收值变为负吸收值。CD Pro二级结构软件分析CTTI的二级结构中，含有12.3％α螺旋，30.9％β折叠，20.1％β转角和36.8％无规卷曲。当CTTI被加热变性后，CTTI的远紫外园二色谱发生一定程度的变化。CTTI的β折叠和β转角分别有7.2％和3.7％变为无规卷曲。荧光光谱和园二色谱均表明，当CTTI受到加热后，其分子构象均发生了变化，导致蛋白质变性。大决明(Cassia obtusifolia)的干燥成熟种子研磨粉碎后，去离子水抽提两次，55℃热变性除去部分杂蛋白、35—55％饱和度硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。利用BAPNA方法确定粗提物具有抑制胰蛋白酶的能力。利用明胶—PAGE和明胶—SDS—PAGE方法分析显示大决明子中含有一种胰蛋白酶抑制剂，进一步利用Trypsin-Sepharose亲和层析和Sephadex G-75分子筛层析，从粗提液中分离纯化得到该胰蛋白酶抑制剂，命名为COTI。SDS-PAGE分析其近似分子量为20 kDa。COTI在还原与非还原状态下的SDS-PAGE均显示为一条带，表明COTI仅由一条链构成。通过MALDI—TOF测定COTI的精确分子量为19812.55Da。COTI的肽指纹图谱中显示有8个主要的信号峰簇，其中有6个单信号峰和2个双信号峰。利用MASCDOT软件在NCBI上检索，未发现有相似的肽指纹图谱，表明到目前为止，尚未有关大决明胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱报道。COTI在pH2—12的环境中有极强的稳定性，能够保持80％的抑制活性。热稳定性实验显示COTI在60℃以下稳定性较高，可以保持近100％抑制活性，但当温度继续升高时，其抑制活力迅速下降，表明CTTI具有较高的热稳定性。COTI在含有二硫苏糖醇的条件下，抑制活性会随时间的推移而逐渐降低。待二硫苏糖醇处理120分钟后，只保留50％的抑制活性，处理12小时后，COTI的抑制活性完全消失。滴定曲线测定COTI抑制胰蛋白酶的表观抑制常数为0.3uM，抑制摩尔比为1：1。胰蛋白酶与COTI的复合物实验也证实胰蛋白酶与COTI能形成1：1的复合物。化学修饰实验表明COTI的活性中心含有赖氨酸残基。在模拟胃酸环境中，COTI能较长时间抵抗胃蛋白酶的水解作用，表明COTI是一种较强的抗营养因子。但是当COTI在受到加热、还原或修饰处理后，COTI会不同程度地失去对胃蛋白酶的抵抗能力，其中还原或修饰处理会导致抗水解能力的完全丧火。进一步利用串联质谱分析肽指纹图谱中的部分信号峰，通过De novoSequencing技术测定了部分信号峰中的氨基酸序列。测定的序列在NCBI上检索，发现它们与许多豆科的Kunitz蛋白酶抑制剂有较高的同源性。因此依据COTI的生物化学性质诸如COTI只由一条多肽链构成，分子量介于18-22kDa范围，只有一个活性中心，对还原剂的不稳定性以及氨基酸一级序列的同源性，我们推测COTI属于Kunitz抑制剂家族。更为重要的是，体外分析酶活性的实验表明，当COTI的浓度为40ug／ml时，能够抑制菜青虫中肠碱性蛋白酶60％的活性，并且COTI的抑制能力与大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂相当。体内喂食实验结果显示，当喂食时间长达6天后，喂食COTI的实验组相对于喂食牛血清白蛋白的对照组，体重减轻30％。此结果表明COTI能够抑制菜青虫的生长，这为进一步开发抗菜青虫的生物试剂奠定了一定的基础。利用蛋白质内源荧光检测COTI在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280nm时，天然COTI的最大发射波长为313nm，表明COTI的荧光只来自于分子中的酪氨酸残基，而并非来自色氨酸残基。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，COTI的荧光光谱发生较大的变化。首先313nm的荧光峰的荧光强度减少12％，其次在345nn处新发生一个色氨酸的荧光峰。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，313nm的荧光峰的荧光强度减少78％。测定COTI的远紫外园二色谱，也能反映相似的构象变化。天然COTI的远紫外园二色谱中的最大吸收正峰位于187nm，最大吸收负峰位于200nm，在190nm处由正吸收值变为负吸收值。CDPro二级结构软件分析COTI的二级结构中，含有4％α螺旋，26.7％β折叠，30.6％β转角和38.2％无规卷曲。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，COTI的远紫外园二色谱发生较大的变化。COTI的β折叠和α螺旋分别减少了15％和增加了28％。而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，β折叠和α螺旋分别减少了12％和增加了10％。荧光和园二色谱分析表明：二硫键、疏水作用、范德华力、氢键和静电作用在维持COTI高级构象方面起着重要的作用。当COTI受到加热、还原或修饰处理后，抑制活性的下降是由于其构象改变所致。荧光光谱不仅可以分析COTI的构象变化，还可以分析COTI与胰蛋白酶形成的复合物的构象变化。COTI—胰蛋白酶复合物的荧光光谱中荧光峰位于326nm。当COTI被二硫苏糖醇处理12小时后，荧光峰位置红移至343nm，荧光强度减少25％；而当COTI的赖氨酸残基被修饰后，荧光峰位置无变化，荧光强度减少76％。这表明当COTI受到还原或修饰后，COTI与胰蛋白酶无法形成正常的复合物，因而抑制活性下降。