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INH是一种主要由性腺产生的糖蛋白激素,由α—亚基和β—亚基(有βA—和βB—)通过二硫键结合组成。在体内,INH主要抑制垂体促性腺激素FSH的合成和分泌;而β—亚基又可能形成能够促进FSH分泌的ActivinA(βA-βA)和可能调控肌肉生长的ActivinB(βB-βB)。本论文研究了鹅抑制素/活化素的三种亚基成熟区cDNA的克隆及其在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达相应的重组融合蛋白,以用于对家禽繁殖和生长的免疫调控研究。
首先抽提各级卵泡卵泡颗粒层和膜层的总RNA,利用特异性引物经PCR反应,得到各亚基成熟肽的cDNA片段,并克隆到pMD18-T Vector用于永久保存。将鉴定的各亚基成熟肽的cDNA序列与GenBank上其它动物相应cDNA序列进行比较,显示鹅α—亚基成熟区cDNA与鸡的核苷酸同源性分别为94.7%,与其它哺乳动物同源性达64.3%—69.9%;βA—亚基成熟区cDNA与鸡同源性达95.7%,与其它哺乳动物同源性达83.5%—86.3%;βB—亚基成熟区cDNA与鸡同源性达99.7%,与其它哺乳动物同源性达80.7%—83%。相应的α—亚基成熟区氨基酸序列与鸡同源性为97.3%,与其它哺乳动物同源性在64%—68.4%,βA—亚基成熟区氨基酸序列与鸡的同源性为99.1%,与其它哺乳动物在97.4%—98.3%;βB—亚基成熟区氨基酸序列与鸡同源性为100%,与其它哺乳动物在95.7%—98.3%。将鹅各亚基成熟肽cDNA片段插入表达载体pRSET—A的BamHⅠ和HindⅢ两位点之间,构建三个原核表达质粒PR-α、PR-βA和PR-βB。将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下分别表达了鹅抑制素α、βA和βB的重组蛋白。α—亚基在0.1mM IPTG诱导5小时后蛋白的表达量达高峰;而βA和βB在0.5mM IPTG诱导4小时后蛋白的表达量达到高峰。
本文的第二部分工作是利用抑制素/活化素的βA和βB两亚基的重组蛋白免疫雄性马岗鹅,以探讨对其繁殖和生长的调控作用。将βA、βB两亚基或牛血清白蛋白(BSA)的重组蛋白分别制成油化疫苗,并对生长马岗鹅从21日龄开始隔3周肌肉注射1ml油乳剂(含1mg重组蛋白)进行主动免疫,对照组鹅则同时用相同剂量的BSA免疫原。鹅在免疫βA或βB后都产生了良好的免疫反应,血液中抗βA或βB重组蛋白的抗体效价均显著高于对照组鹅的水平。鹅在经过3次免疫后即在第80日龄屠宰时,免疫βA组睾丸重量及睾丸占屠体重量比率与对照组鹅的无显著差异;免疫活化素A组脂肪沉积率比对照组高,且差异显著(p<0.05);免疫βB组在活重和反映肌肉生长的指标方面与对照组均无显著差异,但在心肝肌胃占半净膛比率中发现,βB蛋白免疫组极显著地高于对照组(p<0.01)。这些结果说明,免疫抑制素/活化素βA不影响马岗鹅的睾丸或繁殖活动发育,但促进了体内脂肪的沉积,免疫抑制素/活化素βB则虽不影响腿肌和胸肌的生长,但可能会促进内脏(心肝肌胃)肌肉的生长。