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单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是重要的人畜共患李斯特菌病的病原菌,在食品公共卫生领域受到广泛关注,该菌的致病性与调控因子PrfA (positive regulatory factor A)蛋白作用下毒力基因的表达有着密切的关系。PrfA是李斯特菌最重要的毒力调控因子之一,能调节LIPI-ⅠLIPI-Ⅱ上毒力基因的表达,从而对李斯特菌黏附及侵袭宿主细胞、逃离机体免疫应答起到调控作用。虽然目前对PrfA的调控作用有了一定的了解,但是其在Lm致病中的作用尚未完全阐明。本研究通过同源重组技术构建单核细胞增生性李斯特菌的prfA基因缺失株,并在此基础上对突变株的生物学特性和蛋白质组学特性进行鉴定,以期完善PrfA的调控机制,为Lm的致病机理研究提供科学依据。1、单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建采用PCR方法从单核细胞增生性李斯特菌LM4基因组中扩增出prfA基因的同源臂片段prs和plcA。采用SOEing PCR方法将prs、plcA基因连接起来,将连接片段prs/plcA与pMD18-T载体相连并测序。测序正确的质粒经双酶切回收后插入穿梭载体pKSV7中,构建成重组穿梭质粒pKSV7-prs/plcA.将质粒电转化到LM4中,在温度和氯霉素抗性双重选择压力下传8代进行同源重组,然后在无选择压力下传10代将质粒丢失,最终获得prfA基因缺失的菌株LM4ΔprfA。在LM4ΔprfA的回复突变实验中,(?)将prfA基因扩增出来并连接到表达载体pERL3质粒中,转化到DH10β中进行测序。将测序正确的质粒电转到LM4的prfA基因缺失株中,获得LM4AprfA的回复突变株。2、单核细胞增生性李斯特菌PrfA的生物学功能的研究在获得LM4ΔprfA的基础上,对PrfA的生物学特性进行研究。突变株与其亲本株的生长曲线、生理生化特性、对药物的药敏性无显著差异,表明PrfA对生长代谢的影响作用不显著。溶血实验中LM4的溶血效价为24,LM4ΔprfA的溶血效价为0,突变株丧失溶血能力,而prfA回复突变株的溶血活性得以完全恢复,表明PrfA对hly基因具有调控作用。肌醇磷脂酶与卵磷脂酶实验中LM4的周围均出现透明圈,而LM4ΔprfA没有出现此现象,说明突变株细菌失去了磷脂酶活性。生物膜形成实验中,LM4的OD590值为0.8478,LM4ΔprfA的OD590值为0.6772,prfA缺失株与其亲本株之间生物膜形成能力差异显著(p<0.05),表明prfA的缺失可影响生物膜的形成。在细胞侵袭实验中,LM4的侵袭率为1.68%,LM4ΔprfA为0.38%,显示突变株的侵袭力显著下降(p<0.01)。对BALB/c小鼠的LD50实验结果表明,突变株的毒力较亲本株下降了105个数量级,突变株毒力显著降低。3、单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株及其亲本株分泌蛋白的比较蛋白质组学研究本研究采用二维凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS),从蛋白质水平上研究PrfA的调控功能。实验采用基础培养基培养LM4及LM4ΔprfA,离心菌液并用三氯乙酸(TCA)对离心后的培养上清进行沉淀,从而获得分泌蛋白。二维凝胶电泳图谱的差异表达分析显示有31个点,质谱鉴定成功19个点,对应12种蛋白。结果发现已知的毒力相关蛋白有InlC、ActA、LLO,此外还新发现了一些受PrfA调控的蛋白,包括丙氨酸丙氨酰羧肽酶、GW重复表面蛋白。结合实时荧光定量PCR方法对蛋白质组学方法进行验证,结果显示hly、actA、inlC的基因表达量显著下降,丙氨酰氨羧肽酶、GW重复表面蛋白的合成也有降低,这些蛋白与PrfA之间的关系还要进一步研究。本研究成功构建了单核细胞增生性李斯特菌prfA缺失株LM4ΔprfA,并对缺失株和亲本株的生物学特性进行了系统研究,有力证明了PrfA对LIPI-Ⅰ, LIPI-Ⅱ上毒力基因的调控作用,并用比较蛋白质组学方法对PrfA的调控作用进行了探索。