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小麦蚜虫属同翅目蚜科,为刺吸式口器害虫,是世界性小麦重要病虫害之一,能造成小麦减产10%-30%。麦蚜吸食小麦汁液,严重时引起枝叶枯萎甚至整株死亡。此外,蚜虫还是小麦黄矮病等病毒病的传播体,能加重小麦病毒病危害。小麦蚜虫防治方法主要有施用杀虫剂和种植抗蚜虫小麦品种两种途径,其中后者是公认的最为环保、经济、有效的途径。目前,抗蚜虫小麦新品种培育仍以杂交育种为主要手段,即利用来自小麦或其亲缘种属的抗虫基因,通过小麦有性杂交培育抗蚜虫新品种。该方法的有效性受限于可利用的抗蚜虫基因资源,抗虫基因鉴定筛选与抗蚜虫种质创新对培育抗蚜虫小麦新品种具有十分重要的意义。近年来,以RNA干涉(RNAi)为核心的寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术为培育植物抗病虫害新品种开辟了新途径。RNAi是由双链RNA(dsRNA)介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。HIGS技术是通过将含有病原物目的基因片段的反义发夹结构的载体转染到寄主植物中,在转基因植物中产生病原物基因特定序列的dsRNA,通过RNAi沉默侵染寄主植物病原菌内源性基因的表达,从而达到防治病虫害的目的。目前,HIGS技术在很多真菌病原物的基因功能研究和病害控制方面得到应用,逐渐显示出其巨大的应用潜力。HIGS技术的成功与否很大程度上取决于RNA干涉.靶基因(病原菌内源性基因)的选择。因此,小麦蚜虫生长发育和繁殖关键性内源基因的筛选鉴定是利用HIGS技术培育抗蚜虫转基因小麦新品种的重要基础。本研究以为培育抗蚜虫小麦新品种提供新抗源和新技术为出发点,开展了(1)小麦蚜虫新抗源筛选鉴定和(2)小麦蚜虫重要基因鉴定筛选与RNAi沉默效应分析两个方面的研究工作,取得如下结果:1.小麦亲缘种属抗麦长管蚜的筛选鉴定与抗虫基因染色体定位。利用自制的抗虫鉴定装置,以78份中国春为遗传背景的中国春-野生亲缘种属添加系为材料,以蚜情指数为评价标准,进行了苗期麦长管蚜抗性筛选鉴定。结果筛选出1份高抗蚜虫的长穗偃麦草(Agropyron elongatum)的添加系,7份分别来自卵穗山羊草(Ae.geniculata)、尾状山羊草(Aegilops caudata)、易变山羊草(Ae.peregrina)、黑麦(Secalecereale)的中抗蚜虫添加系。在鉴定材料中,抗蚜虫(包括高抗和中抗)添加系8个,占10.2%,感蚜虫材料59份,占73.1%,高感蚜虫材料11份,占16.7%。添加系遗传背景材料中国春表现感蚜虫,通过中国春和中国春-野生亲缘种属添加系蚜虫抗性鉴定结果对比分析,高抗蚜虫的基因被定位在长穗偃麦草的6E染色体上,其它7个中抗基因分别定位于长穗偃麦草5E、卵穗山羊1Mg、尾状山羊草D、易变山羊草1SV和5UV、黑麦7R以及拟斯卑尔脱山羊草6S染色体上。该研究为抗蚜虫小麦新品种选育提供了珍贵的新抗源,并为后续抗性基因的精细定位、克隆及抗蚜虫遗传机制研究等提供了材料基础。2.构建了筛选麦长管蚜生长发育与繁殖过程重要基因的dsRNA饲喂筛选体系。以24孔无菌细胞培养板底部打孔加滤纸正放于水面上3cm处为作为培养麦长管蚜的环境,紫外灭菌的双层石蜡膜夹饲料,饲料配方引自陈巨莲,培养温度为25℃,光照周期16h:8h(L:D),并根据纯饲料标准曲线为判断基础确定饲料对麦长管蚜伤害影响最小的时间段(1-11天)作为饲喂筛选重要基因的时间区间。采用四龄蚜虫为实验对象,接虫于无菌培养板中饥饿5小时后加入饲料,每隔48小时更换新饲料,持续喂养7天更换新培养板的饲喂体系。3.从NCBI等数据库搜索收集蚜科(豆蚜、桃蚜、棉蚜、缢管蚜等)基因序列,设计56对特异引物,通过同源克隆成功从麦长管蚜克隆到37个候选基因片段,并成功合成了 29个候选基因的dsRNA。对其中19个候选基因片段进行了 DNA测序与序列比对分析,结果麦长管蚜的候选基因片段与引物设计所用的蚜科昆虫基因序列同源性均大于90%,均为蚜科昆虫的保守序列。4.利用dsRNA饲喂筛选体系,从29个麦长管蚜的候选基因筛选出2个RNAi沉默引起高致死率的麦长管蚜重要基因(水通道蛋白及ATP合酶基因)。其中水通道蛋白基因dsRNA饲喂导致麦长管蚜死亡率达到40.6%,ATP合酶基因dsRNA饲喂后蚜虫死亡率达到26.5%。此外,葡萄糖脱氢酶基因dsRNA饲喂则促进蚜虫生长发育,死亡率比对照纯饲料饲喂下降19.5%。5.挑选3个dsRNA饲喂死亡率显著提高的基因(水通道蛋白、染色体驱动蛋白、ATP合酶)和1个死亡率下降的候选基因(葡萄糖脱氢酶编码基因)进行基因表达水平的荧光定量分析。结果水通道蛋白、染色体驱动蛋白、ATP合酶水通道蛋白基因表达水平分别下降了 74.8%,36.6%和44.6%;葡萄糖脱氢酶编码基因表达水平上升了 209.0%。对比dsRNA沉默引起的蚜虫死亡率和蚜虫内源基因表达水平荧光定量分析结果,dsRNA饲喂死亡率高的基因其基因表达水平也相应降低,而死亡率降低的基因其基因表达水平则相应提高,两者趋势一致。因此,利用dsRNA饲喂筛选体系,根据dsRNA饲喂后麦长管蚜的死亡率来作为基因RNAi效应评价是准确可行的,麦长管蚜死亡率可以作为衡量其候选基因重要性的评价依据,可以为利用HIGS技术培育抗麦长管蚜转基因后代提供靶基因。6.对5个基因(水通道蛋白、核糖体蛋白、ATP合酶、DNA损伤结合蛋白以及乙酰胆碱受体)设计多个不同区段的靶标位点沉默,结果表明同—基因不同靶位点的沉默导致蚜虫死亡率差异显著。因而在后续试验中应对同一基因的多个靶序列进行沉默,筛选出沉默效应最好的靶位点作为HIGS技术培育抗麦长管蚜新品种的靶标基因序列。