顺式二羟基生物分子是一类十分重要的物质,许多重要的生物分子含有顺式二羟基官能团,如蛋白质组学中的糖蛋白质和糖肽,代谢组学中的修饰核苷以及糖组学中的多糖和寡糖等等。在这些组学研究中,存在着两个亟待解决的关键科学问题：一、很多顺式二羟基生物分子的存在浓度极低,而干扰组分常常以很高的浓度存在,因此需要发展选择性的富集介质和方法；二、同一类的顺式二羟基生物分子的化学性质差异小,现有手段分离困难,需要发展出高分辨的分离方法。针对这两个问题,本论文比较系统地发展了顺式二羟基的生物分子分离和分析的新颖方法：1.应用全柱成像等电聚焦技术建立快速高分辨的促红细胞生成素糖型检测方法促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白类荷尔蒙,在人体中主要由肾脏分泌。重组人促红细胞生成素(rhEPO)主要通过中国仓鼠卵巢细胞系生产。rhEPO不仅是一种具有很高经济效益的蛋白质类药物,也可以作为兴奋剂使用。不同来源的EPO在糖型上会有一定的差异。EPO的糖型分析在生物制药行业的质量控制和体育比赛的兴奋剂检测过程中都有着十分重要的应用。现有的方法存在耗时长,分辨率低等一些缺点。我们利用全柱成像毛细管等电聚焦(CIEF-WCID)技术建立了一种快速高分辨的EPO糖型分析方法,并优化了可能对分离结果产生影响的因素。在最佳的实验条件下,我们可以在5分钟内对rhEPO的糖型进行快速分离,并且结果有很高的重现性。和文献报道的毛细管区带电泳及毛细管等电聚焦方法相比。CIEF-WCID技术在分析速度和分辨率上具有明显的优势。2.硼亲和磁性纳米材料萃取与毛细管电泳离线联用测定顺式二羟基生物分子近年来,功能化磁性纳米材料在生物分子的分离和富集领域得到了越来越广泛的重视,然而磁性纳米材料萃取与分离方法联用的报道并不多见。我们合成了聚间氨基苯硼酸修饰的磁性纳米颗粒,用于顺式二羟基生物分子的选择性萃取,并通过动态pH汇合在线浓缩技术与毛细管电泳离线联用。硼亲和纳米材料展现了对含顺式二羟基的生物分子良好的选择性。动态pH汇合在线浓缩技术可以增大CE的上样量,并将样品浓缩在一个很窄的区带中,克服硼亲和磁性纳米材料萃取与毛细管电泳离线联用过程中灵敏度不匹配的问题。我们优化了动态pH汇合在线浓缩的实验条件,和常规进样方式相比,在最佳条件下动态pH汇合在线浓缩的灵敏度提高了42倍。在实验中我们还发现,N,N-二甲基甲酰胺是一种有效解析加速试剂,可以将解析时间缩短到几分钟内。最后我们采用建立好的联用方法测定了正常人尿液中的核黄素。3.磁性纳米材料萃取和凝胶等电聚焦在线联用于蛋白质分析首次提出了基于磁性材料固相萃取和凝胶等电聚焦在线联用的蛋白质分析策略。联用方法的关键在于采用等电聚焦中的阴极缓冲液或阳极缓冲液作为磁性纳米材料固相萃取的解析液,并以凝胶的上样孔作为联用接口。这样只要磁性纳米材料可以在酸性或碱性条件下完成解析,即可与凝胶等电聚焦联用。萃取了目标蛋白质的磁性纳米材料被加入凝胶的上样孔中。当在凝胶上施加电场时,阳极缓冲液中的氢离子或阴极缓冲液中的氢氧根离子便将抓取在纳米材料上的目标蛋白质解析下来。解析下来的蛋白质随后按照各自的等电点被聚焦到凝胶上的特定位置。硼亲和纳米材料由于具备在酸性环境下释放被抓取的含顺式二羟基的生物分子的性质,因此很适合本章中提出的联用方法。通过硼亲和磁性纳米材料和凝胶等电聚焦的联用我们同时完成糖蛋白的萃取富集和糖型分离。另外,为了验证我们提出的联用原理的普适性,我们还实现了离子交换机理的磁性纳米材料萃取与凝胶等电聚焦的在线联用。总的来说,该联用方法具有选择性好、灵敏度高和分析时间短的优势。4.用于低分子量糖蛋白选择性萃取的多功能硼亲和磁性纳米材料研究低分子量糖蛋白中富含疾病标志物的信息。我们报道一种用于低分子量糖蛋白选择性萃取的硼亲和磁性纳米材料。除了具有磁性纳米材料的普遍特性(易于被外磁场分离)外,本章中报道的多功能磁性纳米材料还具有一下特性：1)尺寸排阻性能,2)特异性萃取糖蛋白,3)保护萃取到的低分子量的糖蛋白不被酶解,4)萃取速度快。对糖蛋白质的特异性萃取源于材料上修饰的间氨基苯硼酸对顺式二羟基生物分子的特异性抓取能力,而材料表面的高分子链赋予多功能纳米材料选择性萃取低分子量的糖蛋白并保护其不被酶解的性质以及萃取速度快的特点。我们通过实验证明了上述设计的可行性。通过调节聚丙烯酸高分子链的长度,可以对分子排阻效应的阈值进行调节。这种多功能纳米材料不仅能萃取低分子量糖蛋白,还可以用于选择性的萃取其他重要的顺式二羟基生物分子,如核苷,寡糖等。5.基于Wulff型硼亲和色谱-多孔石墨化碳色谱-高分辨质谱联用的顺式二羟基生物分子萃取,分离和鉴定方法很多重要的顺式二羟基生物分子在生物样品中的丰度一般很低,而样品中的不含顺式二羟基的干扰分子浓度却很高。因此发展选择性的萃取和富集顺式二羟基生物分子的方法在组学分析中就显得十分重要。硼亲和色谱是目前最有效的富集含顺式二羟基的生物分子的方法。我们建立了基于Wulff型硼亲和色谱-多孔石墨化碳色谱-高分辨质谱联用的顺式二羟基生物分子萃取,分离和鉴定方法。我们采用Wulff型苯硼酸整体柱作为在线固相萃取柱,进行修饰核苷的萃取和富集。选用多孔石墨化碳色谱柱作为分析柱,并与LTQ-Orbitrap XL高分辨质谱联用。LTQ-Orbitrap XL质谱可以提供样品的精确分子量。通过精确分子量我们不仅可以对已知物质进行定量分析,也可以对未知物质进行全面的扫描,并通过精确分子量进行推测。Wulff型苯硼酸整体柱可以在生理条件下特异性的萃取尿样中的修饰核苷,因此在进行尿样分析时可以做到直接上样。我们成功的从人尿液中分离鉴定20种修饰核苷。同时,由于所有被萃取的物质均含顺式二羟基,该联用方法可以减少质谱鉴定中的备选分子,降低数据处理的难度。