背景：梓葛冻干粉针(国家技术发明专利申请公开号201010205703.X)为本团队自主研发的创新中药单体复方注射剂,拟用于缺血性卒中的治疗。前期试验证明梓葛冻干粉针对缺血性卒中模型动物具有保护作用,但其分子机制尚不清楚,本课题拟阐释其对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤保护作用的分子机制。本项研究获得了国家自然科学基金(面上项目81473549,青年项目31402237)、教育部博士学科点专项基金(博导类：20110182110012)、重庆市卫生局中医药科研重大项目(渝中医2010[60]2010-1-4)、重庆市基础与前沿研究计划项目(cstc2014jcyj A80023)、教育部中央高校基本科研业务费(XDJK2014C058)的支持。目的：阐释自主创新中药单体复方梓葛冻干粉针对SD大鼠原代培养大脑皮层星形胶质细胞缺氧/复氧损伤保护作用的分子机制。方法与结果：1.S1D大鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧/复氧损伤模型的建立及鉴定无菌分离新生1-3 d的SD大鼠大脑皮层组织,采用含10% FBS的DMEM-F12(1：1)完全培养基差速贴壁法原代培养星形胶质细胞,旋转震荡220rpm×18h×2次进行细胞纯化,FITC-GFAP结合DAPI荧光双标鉴定,Image-Pro Plus 6.0软件分析细胞纯度。以Earle’s培养液代替完全培养基,置于三气培养箱内37℃恒温培养1h、3h、6h、9h、12h制造缺氧模型,混合气体含量为O2O.2 a%+CO25%。缺氧6h损伤适度后,取出细胞,将Earle’s培养液换成完全培养基,置于95%空气+5%CO2+37℃复氧培养1h、6h、12h、24h、48h。采用倒置显微镜观察细胞生长状态,CCK-8检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI结合荧光显微镜检测凋亡、坏死细胞数量,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot(WB)检测细胞中caspase-3的表达量变化以进行模型鉴定。以正常培养细胞为对照,以细胞生长状态明显改变,活性显著降低,凋亡细胞比率显著升高,caspase-3表达量显著升高作为模型判定标准。结果显示：经纯化后,FITC-GFAP结合DAPI免疫荧光双标鉴定星形胶质细胞纯度为97.67±0.10%,符合试验要求。与正常对照组相比,缺氧1h-12 h受试细胞形态均有显著变化,细胞存活率均极显著降低(P<0.01)且呈进行性加重。缺氧6h,细胞活性显著降至50%左右,适合进行后续试验,故取缺氧6h为后续试验条件。与正常对照组相比,缺氧6h/复氧1 h-48 h细胞存活率均极显著降低(P<0.01),细胞凋亡率均极显著增加(P<0.01),提示缺氧6 h/复氧1 h-48 h模型均属成功模型。但缺氧6h/复氧12h细胞存活率最低,细胞凋亡率最高,caspase-3表达量显著升高(P<0.01),故选择缺氧6 h/复氧12h为后续试验模型条件。2.梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护效果检测以缺氧6h/复氧12h制造星形胶质细胞缺氧/复氧损伤模型,分别以31.25μg·mL-1、125μg·mL-1、500μg·mL-1梓葛冻干粉针进行干预,通过模型细胞的形态学变化,CCK-8检测细胞活性变化,Annexin V-FITC/PI结合荧光显微镜检测凋亡、坏死细胞数量,流式细胞术检测细胞凋亡比率,WB检测caspase-3表达量,评估梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护效果。结果显示：与缺氧6 h/复氧12h损伤模型组相比,31.25μg·mL-1、125μg·mL-1、 500μg·mL-1梓葛冻干粉针组细胞形态损伤较轻,细胞活性极显著升高(P<0.01),细胞凋亡率极显著降低(P<0.01),细胞中caspase-3的表达量极显著降低(P<0.01)。提示梓葛冻干粉针对大鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧／复氧损伤具有保护作用,其保护作用机制可能与抗细胞凋亡有关。3.梓葛冻干粉针与单药对星形胶质细胞缺氧／复氧损伤的保护效果比较设置梓葛冻干粉针、梓醇、葛根素同等剂量对照组,试验方法同上。经台盼蓝计数、CCK-8检测,统计分析比较梓葛冻干粉针与单味药物对星形胶质细胞缺氧／复氧损伤的保护效果优劣。结果显示：梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧6h/复氧1-48 h全程损伤的保护效果,均显著优于同等剂量单体药物梓醇、葛根素(P<0.01,P<0.05)。显示梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护效果显著高于同等剂量的单体药物。4.梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤保护作用的转录组学分析以缺氧6h,复氧0h、12h制造星形胶质细胞缺氧、缺氧/复氧损伤模型,以500μg·mL-1梓葛冻干粉针进行干预,试剂盒法提取各组细胞总RNA并纯化,逆转录合成cDNA,生物素标记cDNA并与Affymetrix RAT2302.0基因表达谱芯片进行杂交,Affymetri 30007G基因芯片扫描仪记录结果并对结果进行生物信息学分析,以mRNA表达量改变2倍以上作为纳入标准筛选指标,分析梓葛冻干粉针对受试细胞转录组的影响。结果显示：(1)与正常对照组相比,缺氧6h模型组mRNA表达量上调的基因为404个,下调的基因为454个。其中HIF-1、MAPK信号通路上调,PI3k/Akt信号通路下调。另外还有焦点粘连、甾体激素生物合成等通路上调,矿物质吸收、肿瘤相关蛋白多糖等通路下调。(2)与缺氧6h模型组相比,500μg·mL-1梓葛冻干粉针组：nRNA表达量上调的基因为31个,下调的基因为40个,但细胞凋亡或增殖信号通路因子表达量差异均在2倍以下,没有达到增减判定的常规标准。上述差异表达基因中,甾体激素生物合成通路的上调得以逆转,另有嗅觉转导通路上调,萜类化合物生物合成及胆汁分泌通路下调。(3)与正常对照组相比,缺氧6h/复氧12h组mRNA表达量上调的基因为515个,下调的基因为634个。其中JAK/STAT信号通路上调,PI3k/Akt信号通路下调。另外还有细胞循环、DNA复制、嘧啶代谢等信号通路上调,嗅觉转导、缝隙连接、错配修复等信号通路下调。(4)与缺氧6h/复氧12h模型组相比,500μg·mL-1梓葛冻干粉针组mRNA表达量上调的基因为36个,下调的基因为88个。其中PI3k/Akt信号通路上调,JAK/STAT信号通路下调,逆转了损伤模型的基因表达变异。此外,嗅觉转导相关因子mRNA的表达量下调得到逆转。对损伤后下调的PI3k/Akt信号通路的上调作用以及对上调的JAK/STAT信号通路的下调作用,可能是梓葛冻干粉针对大鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制。5.部分差异表达基因的qPCR验证以缺氧6h,复氧0h、12h制造星形胶质细胞缺氧、缺氧/复氧损伤模型,以500μg·mL-1梓葛冻干粉针进行干预。按照试剂盒法提取各组细胞总RNA并纯化,逆转录合成cDNA, qPCR法进行JAK2、STAT3、PI3K、Akt、caspase-3 mRNA表达量检测,以验证转录组芯片结果。结果显示：(1)与正常对照组相比,缺氧6h/复氧0h模型组PI3K、Akt表达量极显著降低(P<0.01),caspase-3表达量极显著升高(P<0.01),JAK2、STAT3表达量无显著性差异。(2)与缺氧6h/复氧0h模型组相比,500μg·mL-1梓葛冻干粉针组PI3K、Akt表达量极显著升高(P<0.01), caspase-3表达量极显著降低(P<0.01), JAK2、STAT3表达量无显著性差异。(3)与正常对照组相比,缺氧6h/复氧12h可以引起JAK2、STAT3、caspase-3表达量极显著升高(P<0.01),PI3K、Akt表达量极显著降低(P<0.01)。(4)与缺氧6h/复氧12h模型组相比,500μg·mL-1梓葛冻干粉针组JAK2、STAT3、caspase-3表达量极显著降低(P<0.01),PI3K、Akt表达量极显著升高(P<0.01)。上述结果与转录组芯片结果一致,提示梓葛冻干粉针对大鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧／复氧损伤的保护作用机制与上调PI3k/Akt和下调JAK/STAT信号通路有关。结论：1.缺氧1 h-12h,星形胶质细胞显著损伤并且持续加重。其中,缺氧6h时,细胞存活率降至50%左右,为理想的缺氧和后续试验条件。缺氧6h/复氧1 h-48h,均可引起细胞存活率均极显著降低,细胞凋亡率极显著增加。其中以缺氧6h/复氧12h细胞凋亡率最高,最终取最佳造模条件为缺氧6h/复氧12h。2.梓葛冻干粉针可显著提高缺氧6h/复氧12h损伤模型细胞存活率,抑制细胞凋亡率及caspase-3表达,从而抑制其过度凋亡。3.梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧／复氧损伤的保护效果显著高于组方内所含的相应剂量的单体药物的保护效果。显示处方组成的合理性。4.缺氧6h/复氧12h损伤引起的星形胶质细胞凋亡,与上调HIF-1、MAPK、 JAK/STAT信号通路和下调PI3k/Akt信号通路有关。5.梓葛冻干粉针抗星形胶质细胞缺氧／复氧损伤的机制与下调JAK/STAT和上调PI3k/Akt信号通路有关。