目的免疫佐剂在肿瘤及慢性感染治疗中发挥重要的辅助作用。短棒状杆菌(corynebacterium parvum,CP)是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌,对人体无明显的致病性,是常用的免疫佐剂。CP具有增强非特异性免疫力的作用,在治疗肿瘤和抵抗慢性感染方面取得了令人兴奋的进展,但是由于其副作用较大,临床应用受到一定限制。短棒状杆菌纳米制剂(Non-cell Corynebacterium ParvumProduct,NCPP)是采用先进的纳米技术对CP进行高压超细粉碎和分级处理制备得到的一种新型纳米免疫调节剂。在前期研究中我们证实NCPP不仅保留了CP原有的抗肿瘤和抗感染效应,而且明显减低了CP的副作用。化疗是肿瘤治疗的主要方法之一,但传统的系统性全身化疗副作用大,给病人带来极大的痛苦。近年来肿瘤局部介入化疗在实体肿瘤治疗中得到广泛应用,在保证疗效的前提下明显降低了化疗药的副作用。我们的合作者在前期研究中对现有的局部介入化疗进行改进,建立了瘤内缓释疗法,并取得了良好的抗肿瘤效果。本课题拟将NCPP和瘤内缓释疗法联合应用,一方面利用化疗药物局部的抗肿瘤效应,另一方面利用NCPP在提高机体免疫力方面的优势,达到更加有效治疗肿瘤的目的。方法1.NCPP联合瘤内缓释化疗对C57 BL/6小鼠黑色素瘤的抑制作用将B16黑色素瘤细胞悬液接种于C57 BL/6小鼠。待肿瘤长至5mm×5mm~2,将小鼠随机分为四组进行治疗:①生理盐水(NS)对照组:瘤内和腹腔注射NS;②缓释治疗组:瘤内注射Ara-C+缓释液+二硝基苯(DNP);③NCPP治疗组:腹腔注射NCPP;④联合治疗组:腹腔注射NCPP联合瘤内注射Ara-C+缓释液+二硝基苯(DNP)。7天后重复治疗一次。治疗期间每天测量各组小鼠肿瘤大小,计算瘤体积。治疗14天后处死小鼠,分离取得瘤组织和脾脏。称量瘤重,评价NCPP联合瘤内缓释化疗的抗肿瘤效果。肿瘤标本HE染色观察肿瘤坏死情况。研磨脾脏获得脾细胞悬液,流式细胞术检测脾内T细胞亚群数量。2.NCPP联合瘤内缓释化疗对BALB/c小鼠H22肝肿瘤的抑制作用将H22肝癌细胞悬液接种于BALB/c小鼠。待肿瘤长至5mm×5mm~2,将小鼠随机分为四组进行治疗:①生理盐水(NS)对照组:瘤内和腹腔注射NS;②缓释治疗组:瘤内注射阿霉素+过氧化碳酰胺+二硝基苯(DNP);③NCPP治疗组:腹腔注射NCPP;④联合治疗组:腹腔注射NCPP联合瘤内注射阿霉素+过氧化碳酰胺+二硝基苯(DNP)。7天后重复治疗一次。期间隔天测量各组肿瘤大小,计算瘤体积,记录各组小鼠的生存时间,计算生存率。治疗14天后处死小鼠,分离取得瘤组织和脾脏。称量瘤重,评价NCPP联合瘤内缓释化疗的抗肿瘤效果。肿瘤标本HE染色观察坏死情况。研磨脾脏获得脾细胞悬液,流式细胞术检测脾内T细胞亚群数量。结果1.NCPP联合瘤内缓释化疗对C57 BL/6小鼠黑色素瘤的抑制作用1.1联合治疗能更有效地抑制黑色素瘤的生长为了研究NCPP联合瘤内缓释化疗对小鼠黑色素瘤的抑瘤效果,我们将培养的B16黑色素瘤细胞接种于C57 BL/6小鼠腋窝皮下,待长至适宜大小(体积约5mm×5mm~2)时,分四组进行治疗:①生理盐水(NS)对照组:瘤内和腹腔注射NS;②缓释治疗组:瘤内注射Ara-C+缓释液+二硝基苯(DNP);③NCPP治疗组:腹腔注射NCPP;④联合治疗组:腹腔注射NCPP+瘤内注射缓释化疗药。7天后重复治疗一次。治疗期间每天测量小鼠的肿瘤大小,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。结果显示:治疗后8天内各治疗组间没有明显差异;8天后,NS对照组肿瘤快速生长,缓释治疗组和NCPP组肿瘤生长速度较对照组减慢,联合治疗组肿瘤生长速度最慢,在同一时间点上肿瘤体积差异有明显的统计学意义。处死小鼠解剖出肿瘤组织显示,联合治疗组的肿瘤体积明显小于其他三组,说明单独应用NCPP或瘤内缓释化疗均能抑制肿瘤的生长,但二者联合应用治疗效果更好。1.2联合治疗能更强烈地杀死肿瘤细胞为了进一步评估分析各治疗方案组的疗效,我们对肿瘤组织进行了病理学检测。结果发现:在NS对照组,尽管瘤组织中心出现缺血坏死区,但周边瘤细胞排列密集成片,肿瘤细胞生长旺盛;缓释治疗组和NCPP治疗组瘤组织各部均出现中度片状坏死,但残留的肿瘤细胞仍然生长旺盛;联合治疗组瘤组织内出现大量坏死区域,活肿瘤细胞比例明显减少。说明联合治疗组不仅肿瘤体积小,而且残存的活细胞数比较少。1.3联合治疗能有效上调免疫器官CD8~+T细胞比例为了进一步评估分析各治疗方案对机体免疫力的影响,我们用流式细胞术分别检测脾脏淋巴细胞CD4~+和CD8~+群的改变。结果发现:4个治疗组中,小鼠CD4~+T细胞数量无明显变化,但CD8~+T细胞的数量各组间有明显区别。瘤内缓释治疗能够轻度抑制体内CD8~+T细胞的增殖,NCPP治疗具有提高CD8~+T细胞数量的作用,而联合治疗能更加明显的提高CD8~+T细胞的数量。说明联合治疗具有提高CD8~+T细胞介导的抗肿瘤效用。2.NCPP联合瘤内缓释化疗对BALB/c小鼠肝肿瘤的抑制作用2.1联合治疗能更有效地抑制肝肿瘤的生长为了研究NCPP联合瘤内缓释化疗对小鼠肝肿瘤的抑瘤效果,我们将培养的H22肝肿瘤细胞接种于BALB/c小鼠腋窝皮下,待长至适宜大小(体积约5mm×5mm~2)时,分四组进行治疗:①生理盐水(NS)对照组:瘤内和腹腔注射NS;②缓释治疗组:瘤内注射阿霉素+过氧化碳酰胺+二硝基苯(DNP);③NCPP治疗组:腹腔注射NCPP;④联合治疗组:腹腔注射NCPP+瘤内注射缓释化疗药。治疗期间隔天测量小鼠的肿瘤大小,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。结果显示:治疗后7天内各治疗组间没有明显差异;7天后,NS对照组肿瘤快速生长,缓释治疗组和NCPP组肿瘤生长速度较对照组减慢,联合治疗组肿瘤生长速度最慢,在同一时间点上肿瘤体积差异有明显的统计学意义。处死小鼠解剖出肿瘤组织显示,联合治疗组的肿瘤体积明显小于其他三组,说明单独应用NCPP或瘤内缓释化疗均能抑制肿瘤的生长,但二者联合应用治疗效果更好。2.2联合治疗能更强烈地杀死肿瘤细胞为了进一步分析评估各治疗方案组的疗效,我们对肿瘤组织进行了病理学检测。结果发现:在NS对照组,尽管瘤组织中心出现缺血坏死区,但周边瘤细胞排列密集成片,肿瘤细胞生长旺盛;缓释治疗组和NCPP治疗组瘤组织各部均出现中度或轻度片状坏死,但残留的肿瘤细胞仍然生长旺盛;联合治疗组瘤组织内几乎全部为坏死组织,活肿瘤细胞极少。说明联合治疗组不仅肿瘤体积小,而且几乎没有活肿瘤细胞存在。2.3联合治疗能有效上调免疫器官CD4~+T细胞和CD8~+T细胞比例为了进一步评估分析各治疗方案组对机体免疫力的影响,我们用流式细胞术分别检测脾脏淋巴细胞CD4~+、CD8~+、Foxp3~+分子改变。结果发现:3个治疗组CD4~+T细胞和CD8~+T细胞较对照组均有所增加,缓释治疗组增加最明显,联合治疗组次之。CD4~+ Foxp3~+T细胞缓释治疗组比NS对照组略高,其他2组与NS对照组无明显差别。结果表明:瘤内缓释治疗和NCPP治疗均能提高荷瘤鼠CD4~+和CD8~+T细胞数量,瘤内缓释治疗最明显;瘤内缓释治疗能够提高Treg细胞的数量,而联合NCPP治疗后能够使Treg细胞数量下降至NS对照组水平。2.4联合治疗能有效延长小鼠生存率为了观察几种治疗方法对小鼠生存率的影响,我们对4组小鼠进行了2周的观察。结果发现:NS对照组从第7天开始有小鼠死亡,14天后生存率56%;NCPP治疗组和缓释治疗组均从第12天开始有小鼠死亡,14天后生存率均为78%;联合治疗组到14天未见小鼠死亡,生存率100%。结果表明:联合治疗能够在一段时间内明显提高小鼠生存率。结论1.NCPP联合瘤内缓释化疗能更有效地杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤生长。2.NCPP联合瘤内缓释化疗能够明显提高小鼠生存率。3.NCPP联合瘤内缓释化疗能够产生更高的肿瘤特异性免疫应答,其机制可能与两种治疗方法产生协同效应有关。创新性和意义1.本研究首次将NCPP和瘤内缓释疗法联合应用对多种小鼠肿瘤进行治疗,并获得了满意的疗效,为临床应用提供了实验依据。2.本研究首次证实NCPP联合瘤内缓释疗法能够产生更高的肿瘤特异性免疫应答,其机制可能与两种治疗方法产生协同效应有关。3.本研究对寻求高效、安全、特异的肿瘤治疗方法指出了新的研究方向,对肿瘤治疗的新研究有着重要的理论意义和指导价值。局限性1.NCPP的研究目前仅限于实验室,临床研究尚未开展,限制了该疗法的临床应用。2.瘤内缓释治疗中瘤内注射可能导致肿瘤细胞种植转移。