研究背景目前的统计数据表明,世界糖尿病患者约1.8亿,而到2025年该数字将增至3.0亿。糖尿病是心力衰竭的独立危险因素,既往的研究表明正常人心力衰竭的发病率是1%-4%,但是糖尿病患者心衰的发病率可达到12%。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病代谢异常所引起的特异性心肌病,主要特点为左室扩大和室壁运动减弱,早期主要表现是舒张功能低下,而晚期则表现为收缩功能异常。DCM是糖尿病患者的主要心血管并发症之一,也是糖尿病患者心血管疾病的高发病率和病死率的重要原因。DCM的病因主要包括高血糖、氧化应激、心脏自主神经病变和胰岛素抵抗等,而高血糖在心肌细胞代谢紊乱中起到了重要的作用。DCM的主要病理变化包括心肌间质纤维化,心肌细胞凋亡和心肌细胞自噬。心肌间质纤维化是成纤维细胞分泌的胶原在心肌间质的过度沉积,进而导致了心脏松弛性的降低和僵硬度的提高,进而影响心功能。心肌细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡,是DCM心肌细胞丢失的主要原因。高糖状态可以引起细胞代谢紊乱,内质网和线粒体受损,从而导致细胞凋亡,由于心肌是不可增殖的永久细胞,所以心肌凋亡可导致心肌收缩能力的减低。自噬是调节细胞内大分子和细胞器降解和循环利用的主要代谢通路,自噬功能受损将引起错误折叠蛋白和破损细胞器的积聚,导致细胞死亡。正常成人的心脏代谢主要来自两部分:60%～70%的脂肪酸β氧化和20%～25%的葡萄糖氧化。研究证实,在糖尿病状态下,脂肪酸β氧化和葡萄糖氧化的比例将拉大,脂肪酸β氧化显著上升而葡萄糖氧化进一步降低。脂肪酸氧化可产生大量脂质中间体,其累积在心肌细胞中最终导致心功能受损。脂肪酸还损伤心肌细胞的钙离子调节,导致心肌收缩功能受损;而且脂肪酸氧化会增加活性氧的产生,过多的脂肪酸氧化将引起活性氧的积聚,导致氧化应激,从而对心肌细胞产生损害。研究证实恢复代谢的正常比例可恢复心功能,但是具体的作用机制不明,其是否可调节心肌细胞凋亡、心肌细胞自噬和心肌间质纤维化还有待探讨。在本实验中,我们将运用蛋白质组学技术,给予代谢调节剂曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ),研究能量代谢转变对于高糖诱导下心肌细胞的蛋白作用,以及对高糖诱导下心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌蛋白的作用,探讨能量代谢转变后差异蛋白与心肌细胞凋亡和自噬的相关性,以及和成纤维细胞胶原分泌的关系,并分析其可能机制,为进一步的实验提供理论基础。研究目的1.探讨能量代谢转变对高糖诱导下心肌细胞和成纤维细胞分泌蛋白及心肌细胞蛋白的作用;2.探讨能量代谢转变后三种不同来源的差异蛋白与能量代谢、心肌凋亡、心肌自噬和心肌间质纤维化的关系,为后续实验提供基础;3.探讨能量代谢转变后三种不同来源的差异蛋白与心肌细胞凋亡、心肌细胞自噬和心肌间质纤维化关键调节通路的关系,为后续实验提供基础。研究方法1.实验模型的建立本研究以原代培养的新生大鼠心肌细胞(Neonatal rat ventricular myocytes,NRVM)、H9c2大鼠心肌细胞系和原代培养的新生小鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CF)为研究对象,分成对照组、高糖组和TMZ干预组3组,对照组给予低糖(5.5mmol/L)+甘露醇(27.5mmol/L)刺激,高糖组给予葡萄糖(33mmol/L)刺激,TMZ干预组给予TMZ(10μmol/L)+高糖(33mmol/L)刺激,分别孵育三种细胞,进而收集H9c2细胞、NRVM培养基和CF培养基。2.蛋白的收集无血清培养基中,高糖刺激NRVM和CF 24h,收取上清,浓缩离心管离心,为下一步样品处理做准备。高糖刺激H9c2细胞24h,PBS冲洗后,刮取细胞,多次离心去除血清影响。3.样品处理,质谱及数据分析向收取的细胞中加入细胞裂解液,结合超声波破碎细胞,应用Bradford蛋白质定量法测定蛋白质浓度,随后经过TCEP还原,IDA烷基化,胰酶消化,C18除盐,Nanodrop测定蛋白浓度,TMT标记蛋白肽段或者无标记蛋白定量,最后样品应用Q-Exactive质谱仪进行分析。使用Proteome Discoverer 1.4进行数据库收索;采用GO分类工具对鉴定的蛋白进行分子功能分类与生物进程分类;应用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)软件进行通路分析。结果1.质谱分析结果经过ESI-MS/MS鉴定并通过SEQUEST搜索对比,心肌细胞结果共鉴定出1235种蛋白,对照组与高糖组的差异蛋白为161种,其中123种蛋白发生上调,38种蛋白下调;经过TMZ干预后,上调蛋白中84种蛋白发生回调,29种下调蛋白升高。NRVM培养基共鉴定121种蛋白,高糖组与对照组相比的差异蛋白为26种,其中14种蛋白发生上调,12种蛋白下调;经过TMZ干预后,7种上调蛋白发生回调,2种下调蛋白发生回调。CF培养基共鉴定出1415种蛋白,对照组与糖组的差异蛋白为218种,其中47种蛋白发生上调,171种蛋白发生下调;经过TMZ干预后,其中17种上调蛋白发生回调,163种下调蛋白发生回调。2.TMZ干预后高糖诱导的大鼠心肌细胞差异蛋白表达谱分析与高糖组相比,按照差异蛋白定位分类,TMZ干预组差异蛋白主要包括胞浆蛋白(46.9%),大分子复合物(14.3%)和细胞器蛋白(26.55%)等;按照蛋白的功能分类,TMZ干预组的差异蛋白主要包括具有催化活性蛋白(45.3%),结合活性蛋白(32.6%)和结构分子活性蛋白(14.0%)等。通过对差异蛋白的分析,差异蛋白中与能量代谢相关的蛋白主要包括果糖二磷酸醛缩酶(Aldolase A,Fructose-bisphosphate,Aldoa)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,G6pd)、细胞色素 b-cl 复合体亚基1(Cytochrome b-cl complex subunit 1,mitochondrial,Uqcrcl)等。与凋亡相关的蛋白主要包括胞浆精氨酸-tRNA连接酶(Arginine--tRNA ligase,cytoplasmic,Rars)、丝氨酸蛋白酶(Serine protease,HTRA1)等。与自噬相关的蛋白包括泛素样蛋白激活酶1(Ubiquitin-like modif-ier-activating enzyme 1,Ubal),Hsp90ab1 和 Stat1 等。与pi3k/AKT通路相关的蛋白主要包括粘着斑蛋白(Vinculin,Vcl)、解聚蛋白(Destrin,Dstn)、ADP 核糖基化因子 4(ADP-ribosylation factor 4,Arf4)、Arhgdia、Stat1、Gdi2等;与AMPK相关的蛋白包括三功能性酶亚基α(Trifunctional enzyme subunit alpha,mitochondrial,Hadha)、线粒体延胡索酸酯酶(Fumaratehydratase,Fh)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase,mitochondria,Got2)。3.TMZ干预后高糖诱导下心肌细胞差异分泌蛋白表达谱分析与对照组相比,根据差异蛋白参与的生物过程分类,高糖组分泌的差异蛋白主要包括生物调节蛋白(5.7%)、细胞成分调节蛋白(8.6%)、细胞过程调节蛋白(31.4%)、发育调节蛋白(8.6%)、定位调节蛋白(8.6%)、代谢调节蛋白(22.9%)、多细胞生物过程调节蛋白(8.6%)和刺激反应蛋白(5.7%);TMZ干预后,参与生物学过程的差异蛋白组成转变为生物调节蛋白(12.5%)、细胞成分调节蛋白(6.3%)、细胞过程调节蛋白(25%)、发育调节蛋白(12.5%)、定位调节蛋白(6.3%)、代谢调节蛋白(25%)、多细胞生物过程调节蛋白(6.3%)和刺激反应蛋白(6.3%)。与对照组相比,根据差异蛋白的功能分类,高糖组心肌细胞分泌的差异蛋白包括催化活性蛋白(47.6%)、结合活性蛋白(28.6%)和结构分子活性蛋白(23.8%);与高糖组相比,TMZ干预组心肌细胞分泌的差异蛋白包括催化活性蛋白(37.5%)、结合活性蛋白(37.5%)和结构分子活性蛋白(25%)。经过蛋白质相互作用分析,与高糖组相比,TMZ干预组大鼠心肌细胞分泌的差异蛋白和凋亡相关的蛋白包括膜联蛋白A7(annexin A7,Anxa7)和四个半LIM 域蛋白 2(four and a half LIM domains protein 2,Fhl2)等。与pi3k/AKT信号通路相关的蛋白是解离抑制蛋白(rho GDP-dissociation inhibitor 2,Gdi2)。4.TMZ干预后高糖诱导下成纤维细胞分泌的差异蛋白表达谱分析与对照组相比,根据差异蛋白的功能分类,高糖组成纤维细胞分泌的差异蛋白包括细胞结合活性蛋白(39.70%)、受体活性蛋白(5.80%)、信号转导活性蛋白(3.30%)、抗氧化活性蛋白(0.80%)和转运活性蛋白(5.80%);与高糖组相比,TMZ干预组的差异蛋白包括结合活性蛋白(38.80%)、受体活性蛋白(7.10%)、结构分子活性蛋白(4.30%)、信号转导活性蛋白(4.10%)、催化活性蛋白(38.80%)、抗氧化活性蛋白(1.00%)和转运活性蛋白(5.10%)。与对照组相比,根据差异蛋白参与的生物学过程分类,高糖诱导组成纤维细胞分泌的差异蛋白包括生物调节蛋白(4.90%)、定位调节蛋白(5.30%)、复制调节蛋白(1.50%)、多细胞生物过程调节蛋白(5.8%)、刺激反应蛋白(6.00%)、生物附着调节蛋白(6.00%)、多细胞组分或合成调节蛋白(6.40%)、免疫反应调节蛋白(6.80%)、发育调节蛋白(7.90%)、代谢相关蛋白(20.00%)和细胞过程调节蛋白(29.40%);TMZ干预后,与高糖组相比,成纤维细胞分泌的差异蛋白主要包括生物调节蛋白(6.10%)、定位调节蛋白(5.70%)、复制调节蛋白(1.90%)、多细胞组分或合成调节蛋白(5.70%)、刺激反应蛋白(7.10%)、生物附着调节蛋白(5.20%)、多细胞生物过程调节蛋白(6.10%)、免疫反应调节蛋白(5.20%)、发育调节蛋白(8.00%),代谢调节蛋白(19.80%)和细胞过程调节蛋白(29.20%)。经过蛋白质相互作用分析,TMZ干预组分泌的差异蛋白和能量代谢相关的蛋白包括肌酸激酶(creatine kinase,mitochondrial 2,Ckmt2)、染色体-解旋-DNA-结合蛋白 7(Chromodomain-helicase-DNA-binding protein7,Chd7)和 Aldoa 等与凋亡相关的蛋白包括基因丝动力重链蛋白8(axonemal dynein heavy chain 8,Dnahc8)、Trafl和 Sox5 等。与自噬相关的蛋白关包括Dapk 1和Zc3h 12d,而与mTOR相关的包括Dnahc8和 Smad5。与胶原分泌相关的蛋白包括非肌肉αα-肌动蛋白(non-muscle alpha-actinin 4,Actn4)和 p58/GTA 蛋白激酶(p58/GTA protein kinase,Cdk1 1b)等经过相互作用分析,核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,Gm20390)以及Ppard与AMPK信号通路存在相互作用关系;与piβK/AKT信号通路相关是磷酯酶Cβ1(phospholipase C beta 1,Plcb1)和肌微管素同源蛋白2(myotubularin homologous protein 2,Mtmr2)等;与 AKT 信号通路存在相互关系的蛋白为Fanconi贫血蛋白(Fanconi anemia protein,Fanca)和结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,Ctgf)等。经过蛋白相互作用分析,与MAPK存在相互作用的蛋白包括Smad5、Mapkapk5、parp1、Traf1、Ppard、Dapk1、Plcb1、Grik2、Dnahc8 和 Kcnh8。5.TMZ干预对高糖诱导下心肌细胞中炎症相关蛋白的影响经过IPA软件进行分析,与高糖组相比,TMZ干预组中有18种差异蛋白与炎症相关,其中包括膜联蛋白A3(Annexin A3)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Adenine phosphoribosyltransferase,APRTase)、RNA 解螺旋酶 p68(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)和细丝蛋白 A(Filamin alpha,FLNA)等。6.TMZ干预对高糖诱导下心肌细胞中ROS相关蛋白的影响经过IPA软件进行分析,与高糖组相比,TMZ干预组中有12种差异蛋白涉及氧化应激的调控过程,其中包括G6PD、硫氧还蛋白(Thioredoxin)、17β-羟基类固醇脱氢酶(17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase,HSD10)、热休克蛋白 90β(Heat shock protein HSP 90-beta,HSP90beta)和硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Peroxiredoxin 3,PRX 3)等。7.TMZ干预对高糖诱导下心肌细胞中与心肌肥厚相关调控蛋白的影响经过IPA软件进行分析,与高糖组相比,TMZ干预组中有9种差异蛋白与心肌肥厚的调控过程相关,其中包括腺苷酸环化酶相关蛋白1(Adenylyl cyclase-associated protein 1,CAP1)、二氢嘧啶相关蛋白 3(Dihydropyrimidinase-related p-rotein 3,DPYL3)、溶酶体膜蛋白 2(Lysosome membrane protein 2,LIMP-2)和膜突蛋白(Moesin)等。结论1.能量代谢调节后,高糖诱导下的心肌细胞中有84种差异蛋白发生回调;高糖诱导下心肌细胞分泌的差异蛋白中有26种发生回调;高糖诱导下心肌成纤维细胞分泌的差异蛋白中有218种发生回调,提示能量代谢调节对高糖刺激的干预十分广泛;2.回调的差异蛋白与代谢、心肌凋亡、心肌自噬和心肌成纤维分泌胶原密切相关,提示代谢改变可能在高糖条件下调节以上过程,为进一步研究提供了基础;3.回调的差异蛋白与代谢相关通路PI3K/AKT、纤维化相关通路MAPKs以及凋亡和自噬关键通路AMPK密切相关,提示代谢调节可能通过上述信号通路对心肌细胞和心肌成纤维细胞发挥作用。研究背景随着社会经济的发展以及生活水平的日益提高,人们不健康的生活方式以及饮食习惯成为糖尿病发病的主要诱因。据世界卫生组织的统计数据,2025年全球糖尿病人口预计将增加至3亿,糖尿病已经成为威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一,其造成的社会经济负担以及对人类健康的影响是世界范围共同面临的严峻问题,约有一半的糖尿病患者死于心血管并发症。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者发生心力衰竭和粹死的主要原因,其主要表现为早期无症状的舒张功能受损,进而表现为收缩功能受损,最终发展为有症状的充血性心力衰竭。由于目前糖尿病心肌病患者的不断增加,继续探寻DCM的有效治疗药物具有重要意义。糖尿病心肌病(DCM)作为一种代谢性心肌病,其发病不依赖于冠心病、高血压、瓣膜病以及其他可以导致心功能障碍的心脏疾病。目前DCM的药物治疗主要包括磺脲类、二甲双胍、噻唑烷二酮类(Thiazolidinediones,TZDs)、胰岛素、二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidas’e-4,DPP-4)抑制剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(Angiotensin Receptor Blockers,ARBs)和β受体阻滞剂,但是相关回顾性研究表明,很多类型的糖尿病治疗药物,如磺脲类、TZDs和胰岛素等在改善心衰方面均无明显作用。最近的研究发现强化血糖治疗方法对于DCM的死亡率也无任何影响。流行病学研究表明DCM的发病率仍在不断增加,提示目前针对DCM的治疗方法效果不佳。DCM的发病存在亚临床阶段,因此DCM的诊断极易被忽视以及延误,针对DCM的预防显得尤为重要。以上的研究表明亟需一种新的针对DCM的预防和治疗的方法。糖尿病相关的心脏能量代谢紊乱在DCM的发病过程中起到了重要作用,其特点为脂肪酸β氧化增加和糖代谢减少。既往的研究证实脂肪酸β氧化可增加自由基的产生,其进一步的积聚引起氧化应激,从而导致DCM的发生发展。过度的脂肪酸代谢还可降低跨肌浆网钙离子流,损伤心肌收缩,进而影响心功能;过度的脂肪酸代谢还可抑制糖的利用,进一步损伤糖代谢。研究表明心肌代谢底物的改变远早于DCM的发生,提示代谢底物可能是DCM的启动因素。基于以上研究,恢复脂肪酸β氧化和糖代谢的正常比例,可能开辟出DCM治疗的新方向。DCM的主要发病机制包括心肌间质纤维化,心肌细胞凋亡和心肌细胞自噬。心肌间质纤维化是细胞外基质在心肌间质的过度沉积,进而导致了心脏松弛性的降低和僵硬度的提高,进而影响心功能。心肌细胞的凋亡是细胞的程序性死亡,研究表明在糖尿病状态下,心肌细胞的凋亡比非糖尿病状态增加85倍,由于心肌细胞不可增殖,心肌细胞数目的减少将导致有效收缩单位减少,进一步影响心功能。自噬为细胞内降解及循环利用蛋白、脂质及细胞器等的机制,自噬功能紊乱可影响心肌功能,从而也可影响心功能。我们第一部分蛋白质组学的研究结果表明代谢调节可对心肌成纤维细胞的分泌蛋白、心肌细胞的蛋白及其分泌蛋白的表达水平产生重大影响,而这些差异蛋白的表达与心肌细胞凋亡、心肌细胞自噬和心肌间质纤维化密切相关,提示我们代谢调节可能通过对此三个过程产生作用,从而调控DCM的发展。综上所述,我们提出如下假说:早期促进脂肪酸β氧化向葡萄糖氧化的转变,可以部分预防DCM,机制主要可能是通过调节心肌细胞凋亡、心肌细胞自噬和心肌间质纤维化来实现的。在本实验中,我们建立了 2型糖尿病大鼠模型并给予代谢调节剂曲美他嗪干预,旨在探讨早期代谢底物转变对DCM的作用。研究目的1.建立2型糖尿病大鼠的DCM模型,研究心脏脂肪酸氧化向葡萄糖氧化的转变对DCM的作用;2.探讨能量代谢谢调节在DCM大鼠模型中对心脏结构以及心功能情况的影响;3.研究能量代谢调节在DCM大鼠模型中对心肌间质纤维化、心肌细胞凋亡和自噬的作用;探讨其是否通过PI3K/AKT、MAPKs及AMPK/Bcl-2-Beclin1信号通路发挥心脏保护作用。研究方法1.2型糖尿病大鼠动物模型的建立18只体重120g-140g的雄性SD大鼠(约5周龄),适应性喂养(普通饲料和水)1周后将其随机分为2组,对照组(Control组,n=6)和糖尿病组(DM组,n=12),对SD大鼠行基础水平胰岛素耐量检测(IPITT)和空腹葡萄糖耐量检测(IPGTT)。Control组大鼠喂以基础饲料,DM组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料。4周后再次行IPITT和IPGTT,将DM组出现胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的大鼠一次性给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,27.5mg/kg)。各组大鼠继续喂养原饲料1周,随后检测DM组大鼠的空腹血糖(FBG)及空腹胰岛素(FINS)水平,并计算胰岛素敏感指数(ISI)(公式In[(FINSxFBG)-1])。将连续2次空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠纳入实验。随后将DM组随机分为2个亚组:DM组(n=6)和DM+TMZ组(n=6),TMZ(30mg/kg/day)灌胃8周后,处死大鼠,留取标本。2.腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)及胰岛素耐量实验(IPITT)IPGTT:大鼠禁食12h后经尾静脉取血测定血糖,随后经腹腔注射葡萄糖(1g/kg),分别在注射葡萄糖15min,30min,60min,120min后,于尾静脉取血,使用强生稳步血糖仪监测血糖变化,并通过血糖结果计算血糖曲线下面积(AUC)。IPITT:大鼠禁食4h后经尾静脉取血测定血糖,随后经腹腔注射胰岛素(1unit/kg),血糖测定时间点、测定方法以及AUC的计算同IPGTT。3.血液学指标检测于实验0周、4周、5周、13周时取血进行血液生化分析。大鼠取血前禁食12h,然后于颈静脉窦处取血1ml,离心分离血清后,运用Bayerl650血生化分析仪检测血糖(FBG)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)。运用酶联免疫法测定空腹胰岛素水平(FINS)。4.血压和心率监测使用无创大鼠尾动脉血压测量仪测量大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)以及心率(HR),每只大鼠测量3次,取平均值。5.心导管检测戊巴比妥钠(2.5%)麻醉下,行心导管检测。开胸后将导管从左心室心尖处插入,记录左室舒张末压(LVEDP)和收缩压(LVSP)。6.留取组织学标本将大鼠心脏取出,其中一部分放入多聚甲醛(4%)中,固定1-2周后,石蜡包埋,切为4.5um厚的组织切片。另一部分左室心肌组织冻于-80℃冰箱中,以备 Western blotting 使用。7.组织和形态学分析石蜡切片进行H&E染色,Masson染色和天狼星红染色,分别显示心脏的大体形态和纤维化程度。8..心肌细胞调亡的检测TUNEL法检测左室心肌细胞的调亡水平。9.免疫组织化学染色石蜡切片滴加兔抗大鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ—抗,4℃过夜后,滴加山羊抗兔二抗,DAB显色,苏木素复染。结果显示心肌组织Collagen Ⅰ、Ⅲ的分布和表达水平。图片处理与分析采用Image-Pro Plus 5.0软件。10.Westernblotting 实验提取大鼠左室心肌组蛋白,测定浓度,应用Western blotting检测其中p-AMPK,t-AMPK,Caspase 3,PARP,p-ERK,t-ERK,p-P38,t-P38,p-JNK,t-JNK,p-PI3 K,t-PI3K,p-AKT,t-AKT,ATG5 和 ATG7 的蛋白表达水平13.统计分析计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示。采用独立样本t检验比较两组间的差异,采用one-way ANOVA比较多组间的均数。所有的统计过程均通过统计软件SPSS16.0完成,以p<0.05作为差异有统计学意义。结果1.TMZ改善2型糖尿病大鼠的代谢紊乱实验结果显示:FBG及FINS在4周时开始升高,TG在5周时开始升高,实验末DM组TC、TG、FBG和FINS明显升高。给予TMZ干预后,与DM组相比,DM+TMZ 组 TC、TG、FBG 及 FINS 均明显降低(p<0.05)。2.TMZ改善DCM大鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性高脂喂养4周后,行IPGTT及IPITT检测。IPGTT结果显示,与基线水平相比,DM组大鼠Omin和30min时的血糖水平明显升高(p<0.05),曲线下面积(AUC)明显增加(p<0.05)。IPITT结果显示各个时间点的血糖水平均较基线水平明显升高(p<0.05),AUC也明显增加(p<0.05);实验末,与DM组大鼠相比,DM+TMZ组的IPGTT和IPITT结果表明该组大鼠的血糖水平及AUC均明显降低(p<0.05),显示TMZ干预可以提高糖尿病大鼠葡萄糖耐量以及增加胰岛素敏感性。3.TMZ改善DCM大鼠的左室重构DM组大鼠心脏较Control组心脏明显增大,心脏重量/体重(HW/BW)明显提高(3.39 ±0.07 vs.2.51 ±0.05,p<0.05),HE染色显示左室室壁增厚,肌纤维排列紊乱,间隙疏松,并可见肌纤维断裂;给予TMZ治疗后,DM+TMZ组大鼠较DM组大鼠心脏稍微变小,HW/BW明显减小(2.88 ±0.09 vs.3.39 ±0.07,P<0.05),室壁变薄,肌纤维排列相对致密且有序。4.TMZ改善DCM大鼠的心肌间质纤维化Masson染色及天狼猩红染色显示DM组较Control组肌纤维排列疏松,间质和血管周围存在大量染为蓝绿色的胶原纤维,左室心肌组织胶原容积分数(CVF%)和血管周围纤维化指数(PVCA/LA)明显增加(p<0.05)。给予TMZ治疗后,与DM组相比,DM+TMZ组肌纤维排列较致密,间质和血管周围存在的胶原纤维明显减少,CVF%和(PVCA/LA)明显下降(p<0.05)。免疫组化半定量结果显示相对于Control组,DM组心肌组织胶原Ⅰ/Ⅲ的表达明显增加(p<0.05),而给予TMZ治疗后,心肌组织胶原Ⅰ/Ⅲ的表达明显降低。5.TMZ抑制DCM大鼠的心肌细胞凋亡Tunel染色显示DM组较Control组的心肌细胞Tunel阳性细胞明显增加(p<0.05),Western结果显示cleaved Caspase和Parp的表达同样显著增加(p<0.05)。给予TMZ治疗后,Tunel阳性细胞显著降低(p<0.05),而cleaved Caspase和Parp的表达也显著降低(p<0.05)。6.TMZ提高DCM大鼠的心肌细胞的自噬功能Western结果显示DM组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与Control组相比明显降低(p<0.05),并且ATG5和ATG7表达明显降低(p<0.05);给予TMZ治疗后,DM+TMZ组较DM组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显增加,ATG5和ATG7表达明显升高(p<0.05)。7.TMZ改善了 DCM大鼠心功能实验末,有创心导管法的结果表明,DM组较Control组的舒张末期左室内压力增加,收缩压降低(p<0.05);给予TMZ治疗之后,DM+TMZ组较DM组舒张末期左室内压力明显下降(p<0.05),该实验结果表明TMZ可以有效改善DCM大鼠的左室舒张功能。8.TMZ 对于 PI3K/AKT,MAPKs 和 AMPK/Beclin1-Bcl2 信号通路的调节Western结果表明,与Control组相比,DM组PI3K/AKT通路中的p-PI3K和p-AKT蛋白水平明显降低(p<0.05),MAPK通路中的p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白水平明显增加(p<0.05),通路中的p-AMPK蛋白水平明显降低(p<0.05),Beclin1-Bcl2的结合明显增加(p<0.05)。给予TMZ治疗后,DM+TMZ组较DM组p-PI3K和p-AKT水平明显升高(p<0.05),p-ERK、和p-P38蛋白水平明显增加而p-JNK无明显改变,p-AMPK蛋白水平明显降低(p<0.05),Beclin 1-Bcl2的结合明显增加(p<0.05)。结论1.早期代谢调节可部分预防DCM的发生和发展;2.早期代谢调节可以通过减轻2型糖尿病大鼠的心肌间质纤维化、心肌细胞凋亡以及增强心肌细胞自噬,改善DCM的心室重构;3.早期代谢调节通过激活PI3K/AKT改善胰岛素抵抗,选择性的激活MAPKs减轻心肌间质纤维化以及通过AMPK/Beclin1-Bcl2信号通路抑制心肌细胞凋亡并且促进自噬。