DPP4抑制剂选择性评价方法的建立以及MSG小鼠DPP4活性升高的可能机制和药物的抑制作用　　 随着生活方式的改变，2型糖尿病逐渐在全球范围内广泛流行，并且人数逐渐增加。传统口服抗糖尿病药物，虽然具有良好的降血糖作用，但是都不能缓解由于β细胞功能下降而导致的血糖控制进行性恶化。因此迫切需要具有胰腺β细胞功能改善作用的新的治疗方法，来阻止或延缓2型糖尿病进程。目前仅有肠促胰岛素及它们的类似物或受体激动剂具有此功能。胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)是一种主要的肠促胰岛素，摄食后由肠道L细胞分泌。GLP-1的主要功能有：促进胰岛素生物合成和葡萄糖诱发的胰岛素分泌；促进β细胞增殖并抑制其凋亡等。但是GLP-1极易被二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4，DPP4)降解而失活，在血液中的半衰期不到2 min。因此研究者试图直接补充或通过抑制DPP4活性来间接提高血液中GLP-1的水平来治疗糖尿病。目前针对肠促胰岛素系统的抗糖尿病药物主要分为两大类：GLP-1类似物或受体激动剂和DPP4抑制剂。目前已有5个DPP4抑制剂上市，但是我国尚没有一个具有自主知识产权的DPP4抑制剂上市。　　 为了开发具有自主知识产权的DPP4抑制剂，本论文第一章利用实验室已建立的DPP4抑制剂筛选方法，筛选出部分具有较强DPP4抑制活性的化合物，并对筛出化合物进行了体内降血糖实验，结果显示体外具有较强DPP4抑制活性的化合物，体内同样具有良好的降血糖效果。　　 DPP8、DPP9和DPP4同属于S9b基因家族，它们具有相似的氨基酸序列、三级结构和功能活性。研究发现，选择性DPP8和DPP9抑制剂在动物体内能产生严重的副作用。因此DPP4抑制剂要成为抗糖尿病药物的话，很重要的一点就是对DPP8和DPP9没有抑制活性。因此本文第二章建立了基于重组人源DPP8和DPP9融合蛋白的DPP4抑制剂选择性评价方法，以评价DPP4抑制剂候选化合物的选择性。分别从HeLa细胞和HepG2细胞克隆得到长度均约为2.6 kb的人源DPP8和DPP9的cDNA，PCR扩增后和表达载体pET32-a(+)和pcDNA3.1-(+)连接，构建了原核表达质粒pET32-a(+)-DPP8/9和真核表达质粒pcDNA3.1-(+)-DPP8/9。构建的原核表达质粒转化感受态Rosetta细胞，进行重组人源DPP8/9蛋白的诱导表达、纯化及活性检测，发现具有二肽基肽酶活性。然后通过对DPP8/9酶量和最佳底物浓度的摸索与优化，在体外建立了酶学水平的基于重组人源DPP8/9融合蛋白的DPP4抑制剂选择性评价方法。同时构建的真核表达质粒转染293E细胞，与DPP4抑制剂候选化合物一起孵育，在细胞水平上评价体外选择性不强的DPP4抑制剂，能否进入细胞抑制胞内DPP8/9的活性。最后用建立的选择性评价方法，评价了筛选出的DPP4抑制剂候选化合物对DPP8/9的抑制活性，以确定候选化合物的选择性。　　 MSG(monosodium glutamate)动物模型是一种具有2型糖尿病特征的动物模型，被普遍认可和广泛应用于抗糖尿病药物研究中。最近本实验室研究发现MSG模型小鼠血清DPP4酶活性显著升高，因此本文第三章对MSG小鼠血清DPP4酶活性升高的可能机制进行了初步研究。MSG模型小鼠具有类似人2型糖尿病的特征，包括肥胖、糖耐量异常、胰岛素耐量异常、血清TG和胰岛素水平显著升高、血浆活性GLP-1水平显著下降等。研究发现MSG小鼠血清DPP4酶活性及含量显著升高，其升高的机制可能为：MSG小鼠肝脏组织DPP4基因表达调控相关基因Sp1和NFκB表达上调，引起肝脏组织DPP4基因表达上调，从而造成肝脏组织DPP4含量及酶活性升高；回肠组织DPP4基因表达调控相关基因Sp1、Stat1、Sirt1和NFκB表达上调，引起回肠组织DPP4基因表达上调，从而造成回肠组织DPP4含量及酶活性升高；以及下丘脑组织DPP4基因表达调控相关基因Sp1表达上调，可能引起下丘脑组织DPP4基因表达上调。由于肝脏、回肠和下丘脑组织DPP4表达的上调，导致MSG小鼠血清DPP4含量及活性上升。　　 DPP4抑制剂具有抑制DPP4活性，增加活性GLP-1水平的功能。然而大量研究表明Metformin也具有此功能，同时也有大量研究对此持反对观点。因此本文第四章在MSG模型小鼠上研究了Sitagliptin和Metformin对血清DPP4活性的抑制作用。结果发现：1）Sitagliptin对MSG小鼠血清DPP4活性具有很强抑制作用，而Metformin却无抑制作用；2）Sitagliptin对MSG小鼠血浆活性GLP-1水平有升高趋势，而Metformin则无影响；3）Sitagliptin能显著增加MSG小鼠血清胰岛素水平，而Metformin则无影响；4）Sitagliptin对胰岛β细胞功能有改善作用。