幽门螺杆菌是一种微需氧螺旋状的人类病原菌,世界上约一半人口的胃部都有这种细菌定植。幽门螺杆菌的感染通常发生在儿童时期,若不使用相应的抗生素治疗则会伴随至人终老而不能清除。这种细菌不仅能在人的胃内定植多年,甚至在历史的长河中与人类相伴了一个相当长的时期。基因分析表明,幽门螺杆菌在约58000年前随着人类从东非迁往世界各地并与人类共同进化,且越来越适应人类的胃内环境,给人类造成严重的胃部和十二指肠疾病,甚至胃癌。基于此,1994年世界卫生组织宣布幽门螺杆菌为Ⅰ类致癌因子。幽门螺杆菌中长约40 kb的DNA编码的致病岛一毒素相关基因致病岛(cytotoxin-associated gene pathogenicity island, cag PAI)是一种Ⅳ型分泌系统(type IV secretion system, T4SS),通常由28～30个基因组成。它通过将唯一的效应分子CagA转运至胃上皮细胞,发生磷酸化,激活细胞内的相关信号通路,引起细胞的增殖、分化和细胞延长,形成所谓的“蜂鸟”表型和介导IL-8的分泌来发挥生物学效应。基于cag PAI在幽门螺杆菌致病中的重要作用,国内外学者针对cag PAI开展了一系列研究。cagT基因是cag PAI中的一个关键基因,在由cag PAI引起的宿主病理损伤中扮演一个重要角色。cagT基因敲除菌株能阻断CagA分子转运至宿主细胞,进而阻断宿主细胞“蜂鸟”表型的形成和IL-8的分泌。CagT(HP0532)是cag PAI中的一个蛋白,也是cag PAI的结构基础,与CagY蛋白一起构成了cag PAI的结构框架。CagM(HP0537)是cag PAI的一个重要功能蛋白,cagM基因敲除菌株能够阻断CagA转运至宿主细胞和宿主细胞的IL-8分泌。但目前关于cagT和cagM基因的研究还较少,它们在cag PAI致病中的作用机理研究尚在初始阶段。本研究在前人研究的基础上,进一步探讨了CagT和CagM蛋白的生物学性质以及在幽门螺杆菌引起宿主病理损伤和疾病中的作用。1. CagT、CagM及CagA蛋白的表达、纯化及免疫学性质研究提取26695菌株的基因组,采用PCR技术扩增去掉信号肽的cagM和cagT基因,cagA基因的部分片段,并将扩增的三个片段纯化后采用T/A法克隆至pMD19-T载体。用相应的限制性内切酶切下目的片段,根据目的片段携带的酶切位点,将cagM基因与pQE30载体连接,转化入宿主细胞E. coli M15;将cagT基因和cagA基因片段分别与pET-28a(+)和pET-30a(+)载体连接,转化入宿主细胞E. coli BL21(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导三个重组菌中的目的蛋白表达,重组的CagM、CagT和CagA蛋白均可以可溶和包涵体两种表达形式表达。包涵体洗涤液洗涤CagM和CagA包涵体重组蛋白。采用亲和层析纯化经过洗涤的CagM和CagA包涵体蛋白和CagT可溶蛋白。纯化后的三个蛋白各自免疫家兔制备各自的多克隆抗体。ELISA和Western blotting试验证明三个重组蛋白具有良好的免疫反应性。2.幽门螺杆菌cagT、cagM与cagA基因缺失菌株的构建与鉴定将含有氯霉素基因(Cam)的质粒pHe12和pBluescript SK(-)自杀质粒用SmaⅠ和XbaⅠ酶切后,Cam和pBluescript SK(-)连接。以26695菌株基因组为模板分别扩增cagM、cagT与cagA基因的上下游片段,克隆至pMD19-T载体,三个基因的上游片段用SacⅡ+XbaⅠ酶切后插入含Cam基因的pBluescript SK(-)质粒,下游片段用ApaⅠ+SalⅠ酶切后插入含上游片段和Cam基因的pBluescript SK(-)质粒,分别构建cagM、cagT与cagA基因敲除菌株自杀质粒。三个基因敲除自杀质粒电击转化入26695菌株感受态细胞,在含有25μg/ml氯霉素抗性的平板上筛选敲除菌株。最后用PCR和Western blotting鉴定相应的敲除菌株。三个基因敲除菌株分别命名为ΔcagT、ΔcagM和ΔcagA。这些基因敲除菌株的成功构建为研究CagT和CagM如何在幽门螺杆菌cag PAI转运CagA蛋白进入宿主细胞发挥生物学效应提供了良好的研究工具。3.CagT和CagM蛋白对CagA转运和磷酸化的影响及宿主细胞分泌IL-8的影响摇瓶培养幽门螺杆菌26695菌株、11637菌株、ΔcagA菌株、ΔcagM菌株和AcagT菌株,待菌液浓度达到OD为0.5-1.0时,感染AGS细胞,感染复数为200,检测不同菌株感染后AGS细胞的形态变化、CagA蛋白转运及磷酸化情况和IL-8的分泌。结果显示，26695和11637野生株感染AGS细胞后,AGS细胞在形态上呈现“蜂鸟”表型,CagA蛋白转运至AGS细胞内发生磷酸化,细胞培养上清中有大量IL-8分泌。AcagT菌株和AcagM菌株感染AGS细胞后,AGS细胞在形态没有明显变化,CagA蛋白也不能转运至AGS细胞,这与ΔcagA感染后的结果相同,细胞培养上清中IL-8分泌与阴性对照没有显著差异；与之相反,ΔcagA感染细胞的IL-8分泌与野生株相近。由此证明,CagM和CagT蛋白均是cag PAI IV型分泌系统中对CagA转运至宿主细胞起关键作用的蛋白,且与宿主细胞IL-8的分泌密切相关。4. CagT和CagM蛋白的生物学性质和部分生物学功能研究本部分主要研究了CagT和CagM蛋白的生物学性质和部分生物学功能。首先检测了CagT和CagM蛋白在携带完整cag PAI的幽门螺杆菌野生株中是否发生分子修饰和分子大小变化,幽门螺杆菌野生株破菌后利用Western blotting检测发现,CagT和CagM蛋白在幽门螺杆菌野生株中不发生分子修饰。利用不同的去污剂溶解,超速离心分级分离细菌的菌体蛋白,鉴定CagT和CagM蛋白在细胞膜的定位,结合生物信息学预测,证明CagT和CagM蛋白均位于细菌细胞的内膜和外膜部位。鉴于效应蛋白CagA位于细胞内膜,进一步检测了它与CagT和CagM蛋白之间的相互作用,免疫共沉淀试验的结果表明,CagA和CagT之间存在相互作用,而与CagM不存在相互作用。本试验还用免疫沉淀试验检测CagT和CagM蛋白是否存在于胞外,Western blotting的结果表明,这两个蛋白均不能分泌至胞外,它们功能的发挥只能依赖于锚定在细胞膜上。最后,Western blotting试验证明cagM基因敲除菌株不会影响CagT蛋白的表达。通过上述研究表明,CagT蛋白在幽门螺杆菌T4SS转运CagA进入宿主细胞发挥生物学效应的过程中既作为构成cag PAI不可或缺的一个结构蛋白,又通过与CagA蛋白的相互作用,发挥伴侣分子样蛋白的功能,协助CagA向宿主细胞的转运,因此,CagT在CagA的转运中具有多种功能；CagM蛋白则作为cag PAI转运CagA进入宿主细胞的一个具有关键作用的结构蛋白。