自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune Hemolytic Anemia,AIHA)/Evans综合征是一类产生自身抗红细胞和/或抗血小板抗体为主的免疫性血细胞减少症,B淋巴细胞在AIHA/Evans发病过程中发挥重要的作用,除合成和分泌自身抗体的CD5-B淋巴细胞外,还发现存在CD5~+B淋巴细胞[1-3],既往研究发现CD5~+B淋巴细胞数量与AIHA/Evans综合征疾病的严重程度相关[4],许多研究表明CD5~+B淋巴细胞主要通过分泌IL-10发挥免疫调节功能[5-7]。慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是CD5~+的B淋巴细胞恶性肿瘤性疾病,AIHA是CLL最常见的并发症,文献报道发生率5%~25%[8-11],CLL并发AIHA的机制仍未明了。AIHA/Evans综合征患者CD5~+B淋巴细胞的活化状态如何?与CD5-B淋巴细胞是否类似?与CLL克隆性CD5~+B淋巴细胞是否相同?AIHA/Evans患者CD5~+B淋巴细胞中是否存在具有分泌IL-10和TGF-β1免疫调控细胞?本论文拟检测AIHA/Evans综合征患者、健康对照及CLL患者外周血CD5~+B淋巴细胞表面活化分子CD80、CD86、CD69和CD40,并分析其与临床指标的相关性;同时以上患者检测CD5~+B淋巴细胞分泌IL-10、TGF-β1的功能。故本论文分为CD5~+B淋巴细胞活化分子及分泌功能两方面进行研究。第一部分AIHA/Evans患者CD5~+B淋巴细胞活化分子表达及临床意义目的:检测AIHA/Evans综合征患者外周血CD5~+B淋巴细胞比例及其表面活化分子CD80、CD86、CD69及CD40表达,并且分析其与临床指标的相关性,了解AIHA/Evans综合征患者外周血CD5~+B淋巴细胞的活化状态。方法:研究对象为15例初治AIHA/Evans综合征患者,15例缓解AIHA/Evans综合征患者,健康志愿者18名,CLL组9例,应用流式细胞术(FCM)检测各组外周血CD19~+B淋巴细胞及CD5~+B淋巴细胞比例,并检测各组CD5~+和CD5-B淋巴细胞CD80、CD86、CD69及CD40的表达。结果:1、初治组AIHA/Evans综合征B淋巴细胞占总淋巴细胞比例和绝对值分别为[(19.35±16.20)%、(29.73±19.92)×107/L],均高于缓解[(6.58±4.43)%、(10.96±7.98)×107/L]及健康对照组[(6.69±2.12)%、(9.92±4.03)×107/L](P<0.05)。B淋巴细胞比例及绝对值与HB呈负相关(r=-0.537,r=-0.588,P<0.05),与Ret%呈正相关(r=0.461,r=0.410,P<0.05),与LDH呈正相关(r=0.492,r=0.481,P<0.05)。初治组CD5~+B淋巴细胞占B淋巴细胞[(22.01±15.04)%]高于健康对照组[(12.47±6.47)%,P=0.018]。2、初治组CD5~+B淋巴细胞CD80高于缓解(P=0.017)、健康对照(P=0.006)和CLL组(P=0.001);缓解及健康对照组CD5~+B淋巴细胞CD80均低于CD5-B淋巴细胞(P=0.010,P=0.000)。CD5~+B淋巴细胞CD80与HB、C3、C4均呈负相关(P=0.000,P=0.025,P=0.005),与Ret比例及绝对值均呈正相关(P=0.006,P=0.033)。3、初治组CD5~+B淋巴细胞CD86高于缓解(P=0.04)及健康对照组(P=0.005);CLL组CD5~+B淋巴细胞CD86高于健康对照及AIHA/Evans缓解组(P=0.019,P=0.04)。初治组CD5~+B淋巴细胞CD86高于CD5-B淋巴细胞(P=0.015)。CD5~+B淋巴细胞CD86与HB、C3、C4均呈负相关(P=0.028,P=0.011,P=0.002),与Ret比例及绝对值均呈正相关(P=0.045,P=0.020)。4、初治组CD5~+B淋巴细胞CD69与缓解及健康对照组无统计学差异,CLL组CD5~+和CD5-B淋巴细胞CD69均高于AIHA/Evans及健康对照组(均P<0.05)。5、各组CD5~+B淋巴细胞CD40均无统计学差异;初治及健康对照组CD5~+与CD5-B淋巴细胞CD40无统计学差异;缓解组CD5~+B淋巴细胞CD40低于CD5-B淋巴细胞(P=0.027)。结论:AIHA/Evans患者外周血B淋巴细胞比例及数量增高,以CD5~+B淋巴细胞为主,并处于活化状态,细胞表面的活化分子既与CLL中克隆性CD5~+B淋巴细胞有相同之处,也有不同之处;与健康对照中CD5-B淋巴细胞的也不尽相同,CD80、86在CD5~+B淋巴细胞活化中发挥重要作用,决定了其在AIHA中功能。第二部分AIHA/Evans患者CD5~+B淋巴细胞分泌功能研究目的:检测AIHA/Evans综合征患者分泌IL-10及TGF-β1的外周血CD5~+B淋巴细胞比例,并分析其与临床指标的相关性,了解AIHA/Evans综合征患者外周血CD5~+B淋巴细胞的分泌功能。方法:选取2014年7月至2015年10月于天津医科大学总医院血液科住院的AIHA/Evans综合征患者52例,初治25例,缓解28例,健康对照25名,FCM测外周血分泌IL-10及TGF-β1的CD5~+B淋巴细胞比例;免疫磁珠方法分选外周血B淋巴细胞,实时定量PCR(RT-PCR)检测IL-10及TGF-β1 m RNA表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测血浆IL-10及TGF-β1水平。结果:1、初治组患者外周血CD5~+CD19~+IL-10~+/CD5~+CD19~+淋巴细胞比例[(82.18±14.78)%]高于缓解组[(56.68±24.39)%,P=0.013]及健康对照组[(51.90±22.95)%,P=0.005],三组外周血CD5-CD19~+IL-10~+B淋巴细胞比例无统计学差异。CD5~+CD19~+IL-10~+/CD5~+CD19~+淋巴细胞比例与HB、C3均呈负相关(均P<0.05),与LDH、TBIL、IBIL均呈正相关(均P<0.05)。2、初治组患者外周血B淋巴细胞内IL-10 m RNA表达(62.34±52.84)高于缓解(4.33±3.83)及正常对照组(1.78±1.66)(均P<0.05)。3、初治组患者血浆IL-10水平[(4.01±1.54)pg/ml]低于缓解[(5.08±1.72)pg/ml]及健康对照组[(5.70±1.60)pg/ml](均P<0.05)。4、外周血分泌TGF-β1的CD5~+B淋巴细胞比例、外周血B淋巴细胞TGF-β1m RNA的表达和血浆TGF-β1水平均无统计学差异。结论:AIHA/Evans患者体内存在合成IL-10的调节性B细胞,数量与疾病严重程度相关,但分泌IL-10功能下降;合成和分泌TGF-β1的调节性B细胞数量及功能与AIHA/Evans发病无关。