一、研究背景氨肽酶N(APN,又称CD13,EC3.4.11.2)是一类Zn2+依赖的Ⅱ型跨膜蛋白酶,广泛分布于不同的组织细胞中。CD13是一个外肽酶(ectoenzyme),它能够水解多肽或者寡肽,是与肿瘤的侵袭转移、新生血管生成、镇痛和免疫调节等多方面相关的靶点。现代研究表明,CD13是一种人肝癌干细胞表面生物标志物,而肿瘤干细胞的存在与恶性肿瘤极易复发、转移和耐药的特性密切相关。因此,CD13抑制剂对癌症的治疗具有很大的应用前景。世界上第一个上市的CD13抑制剂是作为免疫调节剂应用的乌苯美司(Ubenimex),它在临床上被用于白血病和恶性实体肿瘤手术和放化疗后的辅助治疗,能够显著提升恶性肿瘤患者手术和放化疗后的生存率。另外,实验证明Ubenimex与传统的细胞毒类药物五氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺、阿霉素等联合用药可显著提高抑瘤效果,逆转肿瘤细胞的耐药。因此,本研究论文主要基于协同前药(mutualprodrug)的设计原理设计、合成了全新骨架的Ubenimex与5-FU及Ubenimex与吉西他滨的协同前药,并对其进行了系统的结构改造优化,最终得到了体内外抗肿瘤活性较好的候选化合物18a。二、Uben imex与5-FU协同前药的设计、合成及抗肿瘤活性研究5-FU和Ubenimex联合应用具有显著的协同作用,因此我们基于协同前药原理,通过化学手段将二者组装成一个整体分子,制备成具有协同作用的化合物。首先,我们将5-FU的片段通过酯键直接连接到Ubenimex的羧基端,设计合成了化合物BC-01(9)。BC-01表现出了与Ubenimex相当的CD13酶抑制活性,以及优于Ubenimex和5-FU的体外抗肿瘤细胞增殖活性。另外,多组动物体内实验结果表明BC-01具有优越的体内抑制肿瘤生长的活性,且口服和静脉给药均有效。然而血浆稳定性实验显示BC-01在血浆中不稳定,代谢较快,阻碍了该化合物的进一步开发。因此我们对BC-01进行结构优化,在Ubenimex和5-FU之间引入了不同链长的氨基酸,设计合成了 6个全新的化合物18a-18f。药效学实验结果表明,这类化合物对CD13酶的抑制活性明显优于BC-01和Ubenimex,其中18f对CD13的IC50值达到了 0.096 μM。另外,化合物18a和18f的体外血浆稳定性较BC-01有了非常显著的提高。进一步的体内初步药代动力学研究表明,18a经静脉注射进入体内后经两步降解产生药物Ubenimex与5-FU。对18a细胞水平的活性测定结果表明,18a能有效抑制多株肿瘤细胞增殖,减少人肝癌细胞PLC/PRF/5中CD13+细胞群的数量(CD13+细胞是一类与肿瘤的耐药和复发都息息相关的细胞群),显著抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在体外形成管腔,抑制大鼠主动脉环微血管的生成以及抑制ES-2细胞的侵袭。在体内研究中,化合物18a 口服和静脉注射均有效,其抗肿瘤活性优于BC-01和口服阳性药卡培他滨(Capecitabine)。此外,18a对5-FU产生耐药的肿瘤仍然具有非常好的抑制活性。体内抑制肝癌肺转移实验结果表明,经18a给药后的小鼠肺部转移的结节数显著减少。在小鼠H22腹水生存期实验中,相比较于空白组,化合物18a能显著延长小鼠的生存期。机制研究表明,18a能显著的提高巨噬细胞的吞噬能力从而增强小鼠的体液免疫。与此同时,我们对18a的合成工艺进行了优化。新工艺不仅提高了收率,缩短了合成步骤,简化了后处理,而且将化合物的纯度提高到了 99.4%。三、Ubenimex与吉西他滨协同前药的设计、合成及抗肿瘤活性研究鉴于5-FU和Ubenimex协同前药的优越活性,我们用同样的设计思路将吉西他滨通过酯键和酰胺键引入到Ubenimex的羧基端,设计、合成一类Ubenimex与吉西他滨互为前药的新型化合物。这一系列的化合物都表现出了较好的CD13酶抑制活性,其中化合物38b对CD13的IC50达到了 0.26 μM,远远优于Ubenimex(3.70 μM)。另一方面,体外肿瘤细胞增殖抑制实验结果也表明,在吉西他滨的4位氨基和5’羟基位引入Ubenimex后,仍然能保持吉西他滨的抗增殖活性。体外稳定性试验结果表明化合物32在120 min内能够完全降解出吉西他滨。进一步的体内药效学研究证实化合物32是一个口服有效的吉西他滨前药。四、基于HDAC的双靶点药物的设计、合成及活性研究我们将HDAC抑制剂MS-275结构中的吡啶环用细胞毒药物5-FU替代,设计合成了全新的拼合化合物46。46具有与MS-275相当的HDAC酶抑制活性,但其体外抗增殖活性低于阳性药MS-275。与此同时,化合物46在人工胃液、人工肠液和人血浆中都非常稳定,不能降解出5-FU。据此推测化合物46具有较好的稳定性,会影响其在体外的协同作用。五、全文总结与展望本研究论文以肝癌干细胞标记物CD13为靶点,综合运用计算机化学、药物化学、生物化学和药代动力学等前沿学科知识,利用协同前药原理,将临床上已上市的CD13抑制剂Ubenimex与细胞毒类药物5-FU或吉西他滨融合到一个分子中设计合成了两个系列共19个全新的具有CD13抑制活性的协同前药。我们对这类化合物进行了系统的分子和细胞水平抑酶活性测定、细胞水平和动物水平抗肿瘤活性测定、初步的药代动力学研究以及相关合成工艺的研究。通过这些研究我们找到了一个极具开发前景的候选化合物18a,同时这一设计思想对于以减毒增效为目的的传统细胞毒类化疗药物的二次开发具有特殊的意义和价值。