目的糖尿病(diabetes Mellitus, DM)及其并发症严重危害人们健康及生活质量,糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是DM最严重的并发症之一,也是糖尿病患者重要的死亡原因。DN早期表现为肾小球内高血压、高灌注、高滤过,进而出现肾小球毛细血管袢基底膜(glomerular basement membrane, GBM)增厚和系膜基质(extracellular matrix, ECM)增多,最终导致肾小球硬化。DN的发病机理极为复杂,系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)和足细胞(glomerular endothelial cells, GECs)在DN的发生展中受到多种因子的影响,导致其功能变化。DN时肾脏局部AngⅡ表达升高,从而引发体内一系列细胞因子紊乱,促进DN的发生发展。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、转化生长因子β1 (transforming growth factor-betal, TGF-β1)及纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminosen activator inhibitor-1, PAI-1)等在肾病发生中甚为重要,其中TGF-β1被认为具有促硬化特质,是导致糖尿病肾小球硬化的主要因素。Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen，Col-Ⅳ)和层粘连蛋白(laminin, LN)是ECM的主要成分,也是衡量ECM积聚的主要指标。PAI-1,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1),作为纤溶系统的主要组成部分,对ECM降解起着重要的作用。另外,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、氧化应激以及抗氧化系统的改变等也与DN相关。缬沙坦(Valsartan, Val)是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)为抗凝抗栓剂,二者在临床上都已用于DN的治疗。本研究观察了Val和LMWH以及二者合用对STZ诱导的单侧肾切除大鼠的肾脏保护作用,并采取体外细胞培养的方式,观察了对系膜细胞,足细胞的细胞因子、基质代谢及抗氧化等方面的作用。方法第一部分缬沙坦和低分子量肝素对糖尿病肾病大鼠模型的影响采用STZ注射合并单侧肾切除制备动物模型。将大鼠右肾摘除,两周后以腹腔注射链脲佐菌素(45mg/kg)复制DN模型。动物分为DN模型组、Val(20mg/kg/d)组、LMWH(600IU/kg/d)组、合用组(V+L, Val 10mg/kg/d, LMWH 300IU/kg/d)组,并设立假手术对照组。实验结束时生化法测定血糖、24小时尿蛋白,ELISA法测定了血清TGF-β1和PAI-1、免疫组织化学方法测定了肾皮质Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)和层黏蛋白(LN),并进行了常规病理检查,测量了基底膜和肾小球面积之比。第二部分缬沙坦和低分子量肝素对大鼠系膜细胞的影响体外培养大鼠系膜细胞,细胞分为对照组、高糖模型组、缬沙坦组(Val 10-6mol/L)、LMWH组(LMWH 25IU/L)以及缬沙坦和LMWH联合应用组(Val：10-6mol/L+LMWH:25IU/L)。采用MTT方法测定了系膜细胞增殖,采用酶谱法测定了基质金属蛋白酶MMP2,9的活性,免疫细胞化学方法测定了GMCs中LN、Col-Ⅳ、MCP-1和MMP-2/TIMP-1的表达,RT-PCR方法测定了MMP-2/TIMP-1, TGF-β1, MCP-1, ELISA测定了细胞培养液中TGF-p1、PAI-1的含量。第三部分缬沙坦和低分子量肝素对小鼠足细胞的影响体外培养大鼠足细胞,细胞分为对照组、高糖模型组、缬沙坦组(Val 10-6mol/L)、LMWH组(LMWH 25IU/L)以及缬沙坦和LMWH联合应用组(Val:10-6mol/L+LMWH:25IU/L)。采用ELISA测定了细胞培养液中MMP-2/TIMP-1的含量。采用酶谱法测定了基质金属蛋白酶MMP2,9的活性。结果第一部分缬沙坦和低分子量肝素对糖尿病肾病大鼠模型的影响1.1对实验性DN大鼠血糖的影响模型组和治疗组与假手术组相比血糖明显升高。但模型组与各治疗组之间无明显差异,各组治疗前后没有差异。1.2对实验性DN大鼠24h尿蛋白的影响DN模型组大鼠尿中白蛋白含量明显高于假手术组,三个给药组均能够明显抑制白蛋白的排出,其中,Val联合LMWH用药组的作用明显优于单Val组。1.3对实验性DN大鼠血清TGF-β1的影响DN模型组TGF-β1明显增高,各药物组与模型组相比,均显示出了对TGF-β1分泌的抑制作用,但各治疗组之间其结果没有显著性差异。1.4对实验性DN大鼠血清PAI-1的影响与假手术组相比,DN模型组PAI-1明显增高。各治疗组与模型组相比,均显示出了对PAI-1分泌的抑制作用,但各治疗组之间其结果没有显著性差异。1.5对实验性DN大鼠肾皮质Col-Ⅳ及LN表达的影响各组给药8周后Col-Ⅳ和LN表达均有明显变化,模型组表达升高,用药后二者的表达均明显降低,与单用药物相比,合用组对Col-Ⅳ表达的抑制作用更为明显。1.6对实验性DN大鼠肾脏形态学的改变PAS染色显示,与假手术组相比,模型组大鼠系膜面积/肾小球面积比值明显增大,各个给药组均能减小该比值,但各个给药组之间没有明显差异。第二部分缬沙坦和低分子量肝素对大鼠系膜细胞的影响2.1.对高糖刺激系膜细胞增殖的影响Val和LMWH均可抑制高糖刺激的系膜细胞增殖,二者联合应用时的抑制作用大于单用Val或LMWH.2.2对高糖刺激的GMC中LN及Col-Ⅳ表达的影响高糖刺激GMC能够使细胞分泌LN及Col-Ⅳ增加。LMWH可使Col-Ⅳ分泌减少,对LN未见影响；单用Val未见对Col-Ⅳ和LN分泌有影响,而两药合用时,可明显抑制Col-Ⅳ和LN的分泌。2.3对高糖刺激系膜细胞MMP-2、9活性的影响高糖刺激可以降低MMPs的活性,Val未见对MMPs活性有影响,LMWH及二者合用均可使MMPs活性明显升高。2.4对高糖刺激系膜细胞MMP-2/TIMP-1表达的影响高糖刺激系膜细胞使细胞MMP-2mRNA表达降低,分泌MMP-2蛋白减少,TIMP-1mRNA表达明显增高,TMP-1分泌增多。用药后可以使MMP-2分泌增加,TIMP-1分泌减少,合用组与单用药组相比,对蛋白的影响未见差异,对mRNA的影响则优于单用组。2.5对高糖刺激的GMC培养液PAl-1的影响高糖刺激可使细胞分泌PAI-1明显增多,药物干预组均显示出了对细胞分泌PAI-1的抑制作用,其中药物合用组对细胞分泌PAI-1的抑制作用明显优于单用Val组。2.6对高糖刺激的GMC表达TGF-β1表达的影响高糖刺激细胞合成TGF-β1 mRNA分泌TGF-β1明显增多,药物干预组可明显抑制其分泌,其中药物合用组的抑制作用明显优于单用药物组。2.7对高糖刺激系膜细胞MCP-1表达的影响高糖刺激使系膜细胞合成MCP-lmRNA和分泌MCP-1明显增多。用药组均能使MCP-1分泌减少,合用组与单用药组相比,其作用更显著。2.8对高糖刺激系膜细胞抗氧化系统的影响细胞经高糖刺激后,SOD、GSH-PX活性明显下降MDA含量明显升高,各用药组可以明显升高SOD、GSH-PX活性,降低MDA含量,且联合用药组较单独用药组作用更明显。同时,可以明显降低细胞内氧化应激状态。第三部分缬沙坦和低分子量肝素对小鼠足细胞的影响3.1对高糖刺激足细胞MMP-2/TIMP-1的影响(ELISA法)高糖刺激下,细胞分泌MMP-2减少,TMP-1分泌增多,药物干预组均显示出使MMP-2分泌增加,TMP-1分泌减少,其中药物合用组对细胞分泌MMP-2/TIMP-1的作用明显优于单用药物组。3.2对高糖刺激足细胞MMP-2、9活性的影响高糖刺激可以降低MMPs的活性,而药物作用后,其活性明显增强,合同的效果大于单用。3.3对高糖刺激足细胞抗氧化系统的影响在各时间点上,细胞经高糖刺激后,SOD、GSH-Px活性明显下降,MDA含量明显升高,各用药组可以明显升高SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,且联合用药组较单独用药组作用更明显。同时,用药后可明显降低细胞内氧化应激状态。结论1.缬沙坦和低分子量肝素均可显著降低DN模型大鼠蛋白尿、减轻肾脏的病理改变。二者合用有明显的协同作用。2.缬沙坦和低分子量肝素可抑制基质成分如Col-Ⅳ和LN的合成或分泌,促进基质溶解酶活性或表达有关,并能降低细胞因子MCP-1、TGF-β1的合成或分泌,是其肾脏保护作用的机制之一。3.缬沙坦和低分子量肝素对肾脏的保护作用,与其抗氧化作用有关。缬沙坦和LMWH均能够显著提高高糖刺激的系膜细胞和足细胞抗氧化酶活性,提高细胞抗氧化能力,二者合用有协同作用。