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本研究选用两种嗜热纤维素酶为代表，研究嗜热蛋白的耐热性相关氨基酸和了解嗜热蛋白耐热机理；同时提高两种纤维素酶耐热性，增强其利用性。两种嗜热纤维素酶分别为来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）的内切葡聚糖苷酶CelA，属于糖苷键水解酶第8家族；来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的β葡萄糖苷酶BglY，属于糖苷键水解酶第1家族；这两种纤维素酶和纤维二糖水解酶协同作用，能降解纤维素为重要的生物能源-葡萄糖。研究中分别以CelA和BglY的DNA序列为起点，采用DNA family shuffling的定向进化策略和不同的理性设计方法，得到一些热稳定性显著提高的点突变，将这些影响耐热性的氨基酸突变点通过整合叠加，分别得到高热稳定性突变体SSH(CelA)和HS(BglY)。
利用全基因合成法，合成了野生型目的基因CelA和BglY的DNA序列，合成前分别对其密码子进行了大肠杆菌偏好优化。采用相同方法合成了用于CelA家族改组的另一个母本，来源于约休梭菌（Clostridium josui）的葡聚糖内切酶CelB。通过重组质粒的构建，成功在大肠杆菌中表达了有活性的外缘野生型蛋白CelA和BglY，然后分别确定了其最佳蛋白表达条件。比较了不同的筛选体系，CelA的突变文库筛选选择了CMC/刚果红板法和随机挑取96孔板筛选法；BglY的突变文库筛选选择了X-gal板筛选法和随机挑取96孔板筛选法。
CelA的改造主要采用了DNA家族改组、关键位点饱和突变和嗜热蛋白统计规律理性设计方法。首先以CelA和CelB为母本，构建了家族突变文库。利用CMC/刚果红板法和和随机挑取96孔液体筛选法，筛选到耐热性T50分别降低15℃和12℃的突变子G12和10G12。对其结构进行比对分析后，构建了10个点突变，寻找到对G12和10G12的耐热性降低起主要贡献作用的点突变子，K249R、P258S、S329N和E355G，其T50相对于CelA分别降低了4.9℃、4.0℃、3.4℃和3.1℃。基于晶体结构分析发现，K249R、P258S和E355G均导致了二级结构稳定性的降低或疏水作用的减少，而S329N未发现重要的作用关系变化，推测该位点能更耐受氨基酸突变。因此在329位点进行饱和突变，筛选到耐热性t1/2为野生型CelA5倍的突变子S329G;根据嗜热蛋白氨基酸偏好性的统计规律，在蛋白表面选择了10个定点突变，寻找到耐热性t1/2分别为CelA的1.2和1.4倍的突变子H194G和S269P。将这三个耐热性提高的点突变子整合为SSH，其耐热性t1/2为CelA的10倍，最适反应温度为85℃，而CelA为75℃。
BglY的改造主要采用了DNA家族改组、嗜热蛋白统计规律理性设计和家族序列比对理性设计方法。以BglY和其他两种本实验室其他人员合成的β-葡萄糖苷酶（BglB和BglC）为母本，构建DNA家族改组突变库，经过X-gal平板筛选法和随机挑取96孔液体筛选法筛选后，未发现耐热性提高的突变子。进而采用理性设计对BglY进行改造。BglY和12条来源于嗜热菌的的β-葡萄糖苷酶序列进行比对，根据同一性(consensus)原则分别从四个保守区域筛选出4个点突变，得到耐热性在93℃的1/2为野生型的1.6倍的突变子H321D；BglY和三条已获得耐热性突变子的嗜温β葡萄糖苷酶进行序列比对，分别从7个保守区域筛选出7个点突变，得到突变子A285Y、F395Y和L4031，其耐热性t1/2分别为野生型的2.2、1.4和1.6倍；采用和CelA相类似的嗜热蛋白理性设计法，在蛋白表面选择了7个点突变子，得到S266P，其耐热性t1/2为野生型的1.8。将5个点突变子组合为HS，其耐热性t1/2为野生型BglY的4.7倍，底物抑制近乎消除。
本研究通过定向进化和理性设计方法，提高了内切葡聚糖苷酶CelA和β葡萄糖苷酶BglY的热稳定性，同时降低了BglY的底物抑制，找到了一些和嗜热蛋白耐热性相关的氨基酸位点。这些嗜热蛋白的耐热性研究结果不仅有助于进一步了解嗜热蛋白的耐热机理，也能为其他蛋白的耐热性改造提供一些线索。