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目的药效学筛选追踪桑叶降糖有效部位,并基于线粒体调节作用研究桑叶有效部位防治2型糖尿病的分子机制,研究桑叶有效部位的活性组分,为2型糖尿病治疗提供新思路和新靶点,为桑叶的开发利用提供理论依据和实践依据。方法1.采用一次性腹腔注射大剂量葡萄糖建立快速高血糖大鼠模型,对富含褪黑素的中药——荷叶、桑白皮、五味子、桑叶、黄芩、姜黄、钩藤、紫花地丁8味中药进行降糖药效筛选;对降糖效果最好的桑叶进行水提物及醇提物的降糖药效比较;将70%桑叶乙醇提取物依次用不同极性溶剂（石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯）萃取,分为石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水部位,以快速高血糖大鼠为模型,以葡萄糖耐量实验为药效评价方法,对降糖效果进行筛选比较。2.将动物分为正常对照组（Control）、模型组（Model）、阳性对照——格列美脲组（GMR）、桑叶乙酸乙酯部位高剂量组（SY-H）、桑叶乙酸乙酯部位中剂量组（SY-M）和桑叶乙酸乙酯部位低剂量组（SY-L）。正常对照组与模型组灌胃给予等量生理盐水,阳性对照组给予格列美脲0.4mg·kg-1,SY高、中、低剂量组分别给予桑叶乙酸乙酯部位药物100mg·kg-1、50mg·kg-1和25 mg·kg-1;灌胃体积为2ml·200g-1,连续给药5w。每天定时记录各组大鼠的饮水量和摄食量,实验d7、d14、d21和d28时,测定空腹血糖;给药d21时,进行腹腔注射葡萄糖耐量实验;给药d28时,进行腹腔注射胰岛素耐量实验;给药d35后,所有动物断头处死,收集全血,离心分装,-20℃保存;分别摘取各组大鼠的肝脏、胰腺、海马、肌肉等组织进行相关指标的测定。3.在上述药效学实验的基础上,测定大鼠海马、肝脏、肌肉组织的ATP含量,,采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法检测大鼠肝脏组织的肝糖代谢关键酶GK、PEPCK、G-6-P、GSK-3βmRNA的表达量,检测大鼠肝脏组织线粒体相关因子ERRa、SIRT1和SRC的mRNA表达量,采用Western-Blotting方法检测大鼠肝脏组织线粒体关键因子PGC-1a、Drp1、Mfn2的蛋白相对表达量。4.结合中压柱层析—反向C18柱色谱分离纯化方法,并用HPLC色谱法检测验证,对降糖效果较好的桑叶70%乙醇提取物的乙酸乙酯部位进行了系统的分离纯化,通过EI-MS、NMR(1H-NMR、13C-NMR)、DEPT等波谱检测技术,检测其结构特征,鉴定化合物。结果1.对荷叶、桑白皮、五味子、桑叶、黄芩、姜黄、钩藤、紫花地丁的降糖药效对比研究发现,与正常对照组比较,快速高血糖模型大鼠30min血糖值及AUC均显著升高（P<0.01）。相比较模型组,30min时,桑叶可显著降低血糖值9.84%（P<0.05）。说明桑叶的降糖效果最好。桑叶醇提物可显著降低快速高血糖模型大鼠30min时的血糖值11.05%（P<0.05）,同时显著降低AUC达8.4%（P<0.05）。说明桑叶醇提物的降糖效果较好。对桑叶不同有效部位的降糖药效筛选研究发现,桑叶乙酸乙酯部位可显著降低模型大鼠30min时血糖值13.20%（P<0.05）。说明桑叶乙酸乙酯部位的降糖效果最好。2.桑叶乙酸乙酯部位降糖效果较好,可显著改善糖耐量异常,改善胰岛素抵抗。给药1 w后至5 w实验结束,与正常对照组相比,2型糖尿病各组摄食量、饮水量均显著增加（P<0.01）,体重均呈下降趋势,模型大鼠TG、LDL-C均显著高于正常组（P<0.01）,HDL-C显著降低28.52%（P<0.05）;2型糖尿病胰岛素水平和HOMA-IR均上升,而胰岛素的敏感性降低。肝脏、胰腺组织发生病理改变。GMR可显著改善糖尿病大鼠的高饮、高食、高血糖、体重下降、血脂代谢紊乱及胰岛素抵抗,保护机体肝脏、胰腺组织。给药3 w后,SY-L组、SY-M组、SY-H组大鼠相比较模型组摄食量分别降低1.49%、9.63%（P<0.05）、13.84%（P<0.01）,分别降低饮水量1.48%、9.77%（P<0.05）、13.77%（P<0.01）,直至实验结束,桑叶给药组均可不同程度的减少模型大鼠的饮水量和摄食量。与模型组大鼠相比,SY给药组大鼠FBG均有下降趋势,第35天时,SY-M和SY-H给药分别使大鼠FBG降低29.05%（P<0.05）和35.59%（P<0.05）。IPGTT测试结果说明,葡萄糖负荷前后0、30、60和120 min不同时间点时,模型组大鼠血糖均显著高于正常对照组（P<0.01）;SY低、中、高剂量组可分别降低T2DM大鼠AUC分别为16.33%,25.02%（P<0.05）,28.42%（P<0.05）。SY组有降低TC、TG、LDL-C趋势。SY-H给药组HDL-C有升高趋势。SY组可一定程度的保护改善肝脏、胰腺病理组织损伤。3.桑叶有效部位的降糖机制研究显示,2型糖尿病大鼠各组织ATP含量均显著低于正常大鼠（P<0.01）,GMR组和SY不同剂量组可显著升高组织ATP含量（P<0.05）。基因RT-PCR结果显示,2型糖尿病大鼠PEPCK、G-6-P mRNA呈现表达过量趋势（P<0.01）,GSK-3、GK mRNA的表达显著降低（P<0.05）,另外,组织SIRT1 mRNA表达有降低趋势,但无统计学差异,而ERRa和SRC mRNA的表达显著下降（P<0.01）,GMR组和SY给药组对这PEPCK、G-6-P两个基因表达过量有降低作用,而对GK的基因表达有升高作用,其中GMR和SY高剂量效果最佳（P<0.05）。2型糖尿病大鼠SY给药组SIRT1 mRNA的表达显著高于正常组和模型组（P<0.01）;相比较模型组,GMR和SY-H给药组显著升高模型大鼠SIRT1 mRNA的表达,同时显著降低ERRa和SRC mRNA的表达（P<0.05）。WB蛋白表达量结果显示,与正常对照组对比,2型糖尿病大鼠PGC-1α和Mfn2蛋白表达显著降低（P<0.05）,GMR和SY-H可显著升高T2DM大鼠的Mfn2蛋白表达（P<0.05）。同时一定程度的升高Drp-1蛋白表达,但无统计学差异。4.通过中压柱层析技术快速分离纯化其桑叶乙酸乙酯部位的主要化合物,经过EI-MS、1H-NMR、13C-NMR波谱分析,最终分离鉴定了槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-β-glucopyranoside）和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferil-3-β-D-Glucopyranoside）,其余成分杂质含量较大,且量较少。结论1.在本实验选择的富含褪黑素的8味中药中,桑叶的降糖效果最好;桑叶醇提物的乙酸乙酯部位为降糖活性部位。2.桑叶乙酸乙酯部位可显著改善2型糖尿病大鼠的糖耐量异常,改善胰岛素抵抗,保护肝脏、胰腺组织的病理损伤。3.T2DM大鼠肝脏组织的ATP含量显著下降,说明线粒体功能受损,分子水平检测结果显示T2DM大鼠线粒体功能障碍,主要表现为线粒体融合、分裂异常,而SY不同剂量组可不同程度的改善这种线粒体功能障碍。4.中压柱层析技术分离纯化效果较好,简单易行,可用于桑叶乙酸乙酯部位成分含量较大的活性化合物的分离。桑叶乙酸乙酯部位作为降糖活性部位,其主要成分为黄酮苷类成分。