论文部分内容阅读
研究背景:动脉粥样硬化性心血管疾病（Atherosclerotic Cardiovascular Disease,ASCVD）是全球致死的罪魁祸首。作为心血管疾病重要的病理基础,脂质浸润学说是AS发病机理比较公认的观点,然而大量的实验研究和许多临床观察表明,除非有炎症,不然单纯的高脂血症并不足以引起AS。因此,AS是由脂质和炎症共同驱动的慢性进展性过程。研究AS炎症病理机制可从靶向抗炎的思路为抗AS治疗另辟新径提供线索,从而加强ASCVD防守线。尽管DNA作为重要的遗传信息在生命中必不可少,但“错误定位”的自身DNA、损伤的DNA或者细胞死亡后溢出的DNA如不能及时被清除、修复,可作为启动因子,引发内源性炎症,导致AS的发生、发展并决定其最终转归。例如TLR9、AIM2已有研究证实通过感应异常DNA促发炎症反应导致AS的发生发展。cGAS作为其中的DNA传感器,正逐渐走进人们的视野,成为研究热点。cGAS最早被发现是作为先天免疫识别外来DNA防御病原体的重要部分,但越来越多的研究发现,通过感应自身“错误定位”的DNA,cGAS还参与各种非感染性环境,包括肿瘤,细胞衰老以及炎性疾病。尽管目前cGAS与AS的关系并不明确,但已有研究证实,AS斑块的不稳定与cGAS下游IFN信号有关。在AS小鼠模型中,使用IFNβ治疗可加速斑块病变的形成,并增加斑块中巨噬细胞的聚积,阻断IFN信号传导能够阻止巨噬细胞在斑块中积累,并防止坏死核心的形成。除此之外,高脂饮食可同时激活脂肪细胞和巨噬细胞cGAS-STING信号通路,从而促进高脂诱导的炎症。众所周知,巨噬细胞贯穿AS的整个过程,并且其表型与AS的转归息息相关。其中,促炎性M1巨噬细胞表型是AS斑块易损不稳定的原因,而抗炎性M2巨噬细胞表型可以增加AS斑块的稳定性。有研究发现,巨噬细胞的胞浆DNA通过激活cGAS诱导巨噬细胞M1表型标志物以及CXCL10表达,使用CRISPR-Cas9技术敲除THP-1细胞中的cGAS可使巨噬细胞M2表型标志物包括CD163,IL-10和CCL17的表达升高。综上所述,我们有理由猜测,cGAS可能参与调控AS。因此,本课题旨在探究cGAS否参与调控AS及其可能的机制。研究目的:（1）研究cGAS是否参与调控AS;（2）研究cGAS是否促进巨噬细胞泡沫化;（3）研究cGAS是否是通过介导巨噬细胞炎症信号通路,改变其表型从而调控AS的进展。研究方法和结果:第一部分:（1）收集临床AS和对照人群的血浆,应用Quant-i T?Pico Green?ds DNA定量试剂盒检测血浆ds DNA的表达,比较AS组和对照人群组血浆的ds DNA水平。此外,以6-8周龄雄性的Apo E-/-C57BL/6小鼠为研究对象,分别予以西方饮食（含高脂）和普通饲料喂养8周、16周后,处死动物通过眼球取血,应用Quant-i T?Pico Green?ds DNA定量试剂盒检测血浆ds DNA的表达。结果发现:AS组血浆中ds DNA水平高于对照人群组,饲养8周和16周中的Apo E-/-小鼠血浆均中存在游离的ds DNA,并且16周后的血浆ds DNA水平较8周后的明显升高。（2）以6-8周龄雄性的Apo E-/-C57BL/6小鼠为研究对象,分为两组,建立AS动物模型,分别予以西方饮食（含高脂）和普通饲料喂养16周后,处死动物,通过免疫荧光染色评估主动脉根部横截面斑块中DNA损伤标志物8-OH-d G的表达情况。结果显示:斑块中存在明显的DNA损伤标志物8-OH-d G,并主要存在于线粒体中。（3）通过GEO2R在线工具分析GEO的数据集GSE40156组间基因差异性表达情况,发现Apo E-/-小鼠主动脉cGAS表达水平随着年龄的增长而升高。（4）收集临床AS和对照人群的外周血,使用应用q RT-PCR检测cGAS的m RNA表达水平。结果发现,与对照人群相比,AS组外周血cGAS的m RNA水平明显升高。第二部分:（1）以6-8周龄雄性的Apo E-/-C57BL/6小鼠为研究对象,分为两组,分别予以西方饮食（含高脂）和普通饲料喂养16周后,应用免疫荧光染色、油红O染色、BODIPY染色、HE染色分析cGAS在主动脉根部横截面斑块的分布,分析其与斑块面积的关系,发现cGAS在Apo E-/-小鼠斑块中高表达,其表达水平与斑块面积、脂质沉积呈正相关,并且主要分布于巨噬细胞中。蛋白免疫印迹分析主动脉斑块组织cGAS蛋白的表达情况,发现西方饮食饲养组的小鼠主动脉中cGAS的蛋白表达水平明显高于普通饲料饲养组。（2）我们使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）刺激Raw264.7巨噬细胞12 h后予以ox-LDL（100 ug/m L）继续孵育24 h,然后进行油红O染色和BODIPY染色,通过免疫荧光检测巨噬细胞的泡沫细胞形成和细胞内脂质蓄积情况。结果表明:与对照组（无RU.521干预）相比,抑制cGAS可减轻巨噬细胞泡沫化和脂质蓄积。（3）使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）刺激Raw264.7巨噬细胞24 h后,予以Dil-LDL继续孵育2 h,使用常规荧光染色方法观察了解胆固醇摄取情况,发现抑制cGAS可减轻巨噬细胞对胆固醇的摄取。（4）使用NBD标记的胆固醇（5 umol/L）孵育Raw264.7 12 h后,加入RU.521（2ug/m L）继续孵育24 h,随后加入浓度为50 ug/m L的HDL诱导胆固醇外流6 h,采用488 nm激发光,510 nm发射光测定荧光强度,计算外流率,发现抑制cGAS对巨噬细胞胆固醇外流无影响。第三部分:（1）使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）刺激Raw264.7巨噬细胞12 h后,提取RNA,使用NEBNext?Ultra TM RNA Libray Prep Kit建库并进行Ilumina测序,以log2FC绝对值≥2且Padj<0.05标准统计分析编码蛋白的差异表达基因（DifferentiallyExpressed Genes,DEGs）,用DAVID在线工具获取与AS相关DEGs的GO富集KEGG通路,同时通过STRING获取其蛋白质互作数据,应用Cytoscape及其插件MCODE构建蛋白质互作网络,使用MCC方法寻找与AS相关的hub基因。结果:总共发现了275个与AS相关的编码蛋白DEGs,主要富集在炎症相关的信号通路,其中Stat1,Irf7为主要的hub基因。接下来,使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）刺激Raw264.7巨噬细胞12 h后,提取RNA,使用q RT-PCR技术检测炎症相关因子（Il1b、Il18、Il10、Arg1、Il1rn）、胆固醇摄取相关的分子Msr1以及主要的hub基因Stat1、Irf7的m RNA水平。结果显示,基因的m RNA相对表达差异与转录组结果相似。（2）通过GEO2R在线工具分析GEO的数据集GSE57614组间基因差异性表达情况,发现cGAS在M1表型的巨噬细胞中表达显著增加。使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）刺激Raw264.7巨噬细胞12 h后,使用LPS+IFNγ（10 ng/m L,20 ng/m L,巨噬细胞M1表型诱导方法）继续孵育Raw264.7巨噬细胞6 h,提取RNA,使用q RTq PCR技术检测巨噬细胞M1表型标志物Il1b、Il6、Tnfa、Cd86的m RNA水平。结果表明,抑制cGAS可下调巨噬细胞M1表型标志分子的m RNA水平。（3）使用cGAS抑制剂RU.521（2 ug/m L）联合STAT1增强剂2-NP（10 u M/L）刺激Raw264.7巨噬细胞12 h后,使用q RT-q PCR技术检测巨噬细胞M1表型标志物的m RNA水平,发现与对照组相比（未使用STAT1增强剂组）,增强STAT1活性可阻止由于抑制cGAS所引起的巨噬细胞M1表型标志物Il1b、Il6、Tnfa、Cd86的m RNA水平下调。研究结论:（1）cGAS可能通过调控巨噬细胞对胆固醇的摄取介导AS;（2）机制上,cGAS可能通过STAT1介导巨噬细胞炎症反应,促进M1表型转化,从而促进AS的进展。这一研究揭示了cGAS与AS的关系,并阐述了其通过炎症介导巨噬细胞M1表型转化的作用机制,为AS靶向抗炎治疗开辟新路径提供了重要的研究依据。