埃博霉素(epothilone)是由粘细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物,与著名的抗癌药物紫杉醇(taxol)具有类似的抗肿瘤机制,即促进微管蛋白聚合,稳定微管结构,抑制肿瘤细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成,进而抑制其生长。由于分子量更小,水溶性更好,对于多重耐药肿瘤细胞仍有很好的抑制活性,埃博霉素被认为是紫杉醇的更新替代产品。作为极具潜力的抗癌药物,埃博霉素迅速成为国内外生物和医药学等多个领域的研究热点。目前,埃博霉素主要通过微生发酵进行生产制备,由于发酵产量低,分离困难等原因,埃博霉素高昂的生产成本使其成为临床抗癌药物中的“天价药”。近年来,相关研究人员陆续尝试了在不同异源宿主中表达埃博霉素生物合成基因簇,但是表达产量远远低于本源菌。黄色粘球菌作为纤维堆囊菌的近缘宿主,因为其可以提供丰富的前体物质,生长代时更短,而且遗传操作体系成熟,被证明是高效表达埃博霉素的一个友好宿主。对于此类友好宿主,通过遗传改造提高埃博霉素基因簇在宿主中的表达水平,可能是从根本上解决埃博霉素异源表达低产问题的最直接途径,但是目前国内外对此方面的研究尚处于空白。本实验室在前期的工作中通过转座的方式将So0157-2的埃博霉素基因簇及上下游侧翼序列整合至黄色粘球菌DZ2的基因组中,获得突变菌株ZE菌,成功实现了埃博霉素的异源表达。借助于这样一个高效的异源宿主平台,我们围绕着进一步提高埃博霉素异源表达产量这一目标,对菌株的发酵条件进行了初步的优化,并且对埃博霉素基因簇的转录调控和宿主展开了一系列遗传改造研究。首先,我们对ZE菌的发酵条件进行了初步的研究,通过多个批次的发酵实验确定了菌株在实验室摇瓶发酵条件下的最佳接种比例和最佳发酵周期。在培养基中添加油酸甲酯不仅可以促进菌株的生长,也可以提高菌株中埃博霉素基因簇的转录水平,进而使得埃博霉素的异源表达产量获得约十倍的提升。为了更为直接有效地调控埃博霉素的合成,我们试图寻找与其相关的调控基因。本课题组在前期工作中发现,在So0157-2插入失活基因簇上游紧邻的一个基因后,埃博霉素的产量提高4倍,说明该基因的表达可能抑制埃博霉素的合成,并由此将该基因命名为esi(epothilone synthesis inhibitor)基因。随后,本论文在埃博霉素异源表达菌ZE中对这一结果进行验证,发现esi基因的表达水平与埃博霉素基因簇的转录水平及埃博霉素产量存在负相关。结合生物信息学分析预测和体外实验验证,我们确证esi基因所编码的蛋白可以结合埃博霉素基因簇的启动子并对基因簇的转录进行负调控,而且最佳的结合位点位于基因簇启动子转录起始位点下游的一个17 bp的特殊序列。这是目前报道的第一个,也是唯一一个埃博霉素的转录调控因子。在ZE菌株中敲除该负转录调控因子,埃博霉素基因的转录水平显著上调,埃博霉素的产量提高38%。启动子是调控基因转录水平的核心,所以我们试图使用内源性的强启动子来替换基因簇的原始启动子Pepo。我们选择了黄色粘球菌中两个高表达内源基因的启动子PpilA和PgroEL1,使用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因在大肠杆菌中证明PpilA和PgroEL1表现出远高于埃博霉素基因簇启动子Pepo的转录活性。但是使用PpilA和PgroEL1分别替换Pepo后,埃博霉素的产量显著降低,降幅达80%。随后,我们在黄色粘球菌中详细分析了三种启动子表达gfp基因和埃博霉素基因簇的时间模式,发现Pepo启动子在培养初期保持稳定而较低的转录活性,在培养后期转录活性显著增强,而PpilA和PgroEL1在菌株生长初期的转录活性很高,但是随着培养时间的延长,转录活性迅速下降。埃博霉素是一类次级代谢产物,一般认为在细胞生长的后期或稳定期开始大量合成,所以PpilA和PgroEL1启动子这种先高后低的表达时间模式不适合用于埃博霉素的合成。以上研究结果揭示了部分强启动子不适用于表达次级代谢产物的原因,也提示我们在通过启动子改造过表达目的基因时,除了启动子的转录强度,启动子转录基因的时间模式也应当作为一个重要的指标进行考量。埃博霉素的生物合成基因簇包含7个组成基因,各基因表现出不同的转录频率和转录丰度。基因簇内部转录水平低的基因,有可能成为限制埃博霉素合成速率的限速步骤。我们在埃博霉素基因簇内部不同位置插入额外的启动子,有效提高插入位点下游基因的转录水平,进而提高埃博霉素的表达产量。例如在epoB基因前分别插入Ppil4后,epoB、epoC和epoD的转录水平分别提高了 8.5倍,4.1倍和2.6倍,而埃博霉素的总产量分别提高34%。在同一位置插入Paph后,对基因簇转录和埃博霉素产量产生类似影响,只是影响程度较弱。此外,我们注意到启动子的插入对上游基因的转录产生不利影响。在epoE基因前插入Paph后,epoP-epoD的转录水平均显著下降,对应的埃博霉素产量也下降90%。启动子插入实验展示了通过协调基因簇各基因转录水平来调控埃博霉素产量,进而由此寻找埃博霉素合成过程中限速步骤的可行性,但是实验策略有待完善。黄色粘球菌可以合成大量PKS/NRPS次级代谢产物,内源性次级代谢产物与埃博霉素的合成竞争大量的前体物质和能量,所以我们试图对这些内源性的次级代谢基因簇进行失活。通过软件预测,在黄色粘球菌DZ2中可能存在24个次级代谢基因簇,其中仅有6个被详细研究并鉴定到了对应的产物。我们优先选择了 5个产物产量较高的PKS/NRPS基因簇,通过敲除关键基因对产物合成途径进行失活,最终成功获得4个次级代谢基因簇的单失活突变株。4个突变株具有类似的生长曲线,说明失活次级代谢基因簇对宿主的生长速度没有明显的影响,但是其中两个突变株中埃博霉素产量显著提高(提高幅度分别为34%和19%),而另外两个突变株的埃博霉素产量显著降低(降低幅度分别为61%和80%)。以上实验结果说明失活宿主菌内源性次级代谢基因簇对埃博霉素的合成产生截然不同的影响,反应出宿主内次级代谢复杂的调控网络。宿主菌中仍有大量内源性次级代谢基因簇有待研究,每个基因簇的逐个单失活实验可以规避产生不利影响的基因簇,有效筛选出敲除后能够促进埃博霉素合成的基因簇。我们预期通过多个基因簇的组合失活,不仅可以进一步提高埃博霉素的表达产量,也可以为精简宿主基因组,构建适合表达埃博霉素的底盘生物奠定初步的实验基础。综上所述,我们利用实验室前期构建的埃博霉素异源表达宿主平台,在优化异源表达菌株发酵条件的基础之上,利用异源宿主成熟的遗传操作体系,通过鉴定并敲除埃博霉素基因簇的负转录调控因子,基因簇的启动子改造和宿主菌内源性次级代谢基因簇的失活,有效提高了埃博霉素在异源宿主中的表达产量。以上三种改造思路均能不同程度地促进埃博霉素的合成,我们预期通过整合不同改造策略,可以实现促进作用的累加,大幅提高埃博霉素的异源表达产量,使其能够媲美甚至优于本源菌。构建高产的埃博霉素异源表达菌株不仅有助于实现埃博霉素的高效率规模化生产,创造巨大的经济价值和社会效益,也使得通过遗传改造定向改造埃博霉素成为可能,为筛选新型抗肿瘤药物提供更多选择。