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B7家族是最重要的共刺激分子,在调节T细胞的活化和免疫耐受的动态平衡中起重要调节功能。B7-H4(B7X,B7S1),是B7家族的新成员之一。人的B7-H4基因含有5个内含子和6个外显子,位于人染色体的1p11.1。B7-H4与B7家族其他分子一样,高表达于多种肿瘤组织,例如肺癌,乳腺癌,卵巢癌,胃癌等,而在正常人体组织中却低表达或不表达,这使得B7-H4有望成为一种新的肿瘤标志物。另外,B7-H4作为负性刺激因子,当与其受体结合后,抑制T细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌,可以推测B7-H4在肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和维持机体的免疫耐受过程中发挥重要作用。然而同样对T细胞信号通路有影响的B7-H4受体还没有被克隆出来,对其报道也不是很多,对于受体的研究有助于我们进一步了解B7-H4在肿瘤组织中的作用机制,并有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点。本课题通过构建乳腺癌细胞株MCF-7与急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株共培养体系,模拟体内肿瘤环境,用本科室已制备的鼠抗人B7-H4单克隆抗体5C8阻断MCF-7细胞株上B7-H4分子,抑制B7-H4分子负性调控作用,共培养后检测Jurkat细胞生物学特性的改变。在炎症浸润的人扁桃体部分淋巴细胞中检测到B7-H4受体的表达,并以此为免疫原,制备鼠抗人B7-H4受体的单克隆抗体。一、鼠抗人B7-H4单克隆抗体功能研究【目的】构建共培养体系,研究B7-H4对Jurkat细胞生物学功能的改变。【方法】流式细胞仪技术检测MCF-7细胞B7-H4的表达和Jurkat细胞上B7-H4受体表达,将两细胞共培养72h,收集与MCF-7贴在一起的Jurkat细胞,对其表面CD3、CD69分子表达通过流式细胞技术进行检测,并采用CCK8法对Jurkat的增殖情况进行检测。【结果】MCF-7细胞表面的B7-H4分子能够作用于Jurkat细胞株,促使其细胞表面CD3、CD69分子下调表达,抑制Jurkat细胞增殖。加入B7-H4单克隆抗体5C8共培养后,Jurkat细胞上分子表达和增殖情况则恢复。【结论】B7-H4是一种负性共刺激分子,能够抑制T细胞的增殖和膜分子的表达。二、鼠抗人B7-H4受体单克隆抗体的制备【目的】鼠抗人B7-H4受体单克隆抗体制备,并对其生物学功能进行检测。【方法】以炎症浸润的扁桃体细胞分选出的淋巴细胞作为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c小鼠。取脾脏研磨,与小鼠骨髓瘤细胞株SP2.0融合为杂交瘤株。采用流式细胞技术对杂交瘤株上清进行检测,筛选出阳性杂交瘤株。以B7-H4-mFc-FITC为基础,通过位点竞争抑制实验进一步筛选。将本科室B7-H4受体洗脱蛋白包板后,采用ELISA法对杂交瘤株进一步筛选。对初步确定的杂交瘤株用快速试纸法测定亚型。【结果】筛选出两株疑似的B7-H4受体单克隆抗体命名为3B2和2E2。经位点竞争和ELISA法初步鉴定,3B2比2E2效果稍好,并测定两株抗体的亚型均为IgG2a类。【结论】初步确定获得两株B7-H4受体单克隆抗体的细胞株,该抗体的功能还有待研究。为进一步研究B7-H4与B7-H4受体的分子机制提供基础。