在骨科临床工作中,多种因素导致的大段骨缺损与骨不连仍旧是困扰骨科医生的世界性难题。目前临床上常用的治疗方法有自体骨移植、异体骨移植、人工骨填充等。但由于供区受限、免疫原性、缺乏生物活性等原因限制了这些方法的临床应用。组织工程骨的出现给这一问题的解决提供了一种可行的方法。而组织工程骨的血管化和神经化是组织工程骨实现临床转化的重要技术难题。因此研究组织工程骨血管化和神经化的机制,寻找血管化和神经化的最佳途径是骨组织工程研究的当务之急。课题组以往研究发现:血管束和感觉神经束植入组织工程骨后具有同等促成骨和神经化作用。然而实验中所用的血管束本身含有大量交感神经分布于血管外膜支配中膜平滑肌。其促成骨和神经化作用是血管本身的作用还是外膜交感神经的作用?血管和神经在促进组织工程骨神经化和血管化过程中起着怎样的协同作用?它们相互之间是怎样的关系?这些仍是未知的科学问题。为此,本实验首先尝试使用显微外科方法剥除家兔股动脉血管外膜,建立血管壁局部去交感神经的模型,然后将局部去交感神经血管和正常血管束分别植入组织工程骨,对比观察其对组织工程骨成骨影响,阐明血管和神经在组织工程骨修复大段骨缺损过程中的作用。第一部分显微外科技术构建家兔股动脉局部去交感神经模型目的研究显微外科技术在体内去除兔股动脉交感神经的可行性,排除血管外膜交感神经的影响,为进一步研究组织工程骨神经化机制提供可靠的动物实验模型。方法21只新西兰大白兔随机分4组:对照组(n=3)、4周组(n=6)、8周组(n=6)、12周组(n=6)。分离21只新西兰大白兔双侧股动脉,实验组在手术显微镜放大10倍视野下于股动脉中段剥除血管外膜;对照组仅做血管显露。于术后4周、8周、12周分别取材行苏木精·伊红(he)染色观察血管壁结构、乙醛酸荧光染色观察交感神经分布及其荧光强度、westernblot检测交感神经特异性蛋白酪氨酸羟化酶(th)的含量。结果he染色的结果:3个实验组动脉外膜层缺失或明显变薄,平滑肌层和内膜无明显增厚或者变薄,对照组动脉血管各层结构完整。乙醛酸染色结果:对照组、4周组、8周组、12周组的荧光强度a值分别为:0.08124±0.00260、0.02920±0.00206、0.02661±0.00233、0.03094±0.00211,n=6各实验组与对照组相比荧光分布范围明显缩小,荧光强度显著减弱,差异有统计学意义(p<0.05),各实验组之间的荧光强度差异无统计学意义(p>0.05)westernblot结果:对照组、4周组、8周组、12周组wb条带半定量分析值分别为:0.8626±0.03519、0.3631±0.03019、0.3964±0.02239、0.3487±0.02356,n=6各实验组与对照组相比,th的含量均明显减少,结果具有统计学意义(p<0.05);而3个实验组间差异无统计学意义(p>0.05)。结论显微外科手术剥除法可有效去除动脉血管外膜的交感神经。该方法作用持久,交感神经去除彻底且在4周、8周、12周3个观察点内无论从神经递质方面还是特异性蛋白方面都没有观察到交感神经的明显再生,故该方法可为研究单纯血管因素对组织工程骨的影响提供持久、有效、可靠的动物模型。目的将种子细胞bmsc与β—tcp多孔生物陶瓷支架材料复合培养,使种子细胞bmsc能够在支架材料上成活和生长,确保体内实验的顺利进行。方法取胎兔原代bmsc,培养至p3代,以107/ml的密度接种于β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,材料为长方体,高15mm,底面为4mmx4mm的正方形。以负压吸引法排除材料内的气体,使细胞悬液充分进入材料,随后放入培养皿中复合培样。复合培养5天后用戊二醛固定样本,于扫描电镜下观察bmsc的贴附和生长状态。结果36小时后观察可见bmsc贴壁生长,呈长梭形,但仍有大量未贴壁的杂质细胞。传代后胎兔bmsc生长状态良好,贴壁生长呈长梭形或漩涡状,杂质细胞逐渐减少。bmsc与β—tcp多孔生物陶瓷支架材料复合培养5天后,扫描电镜下观察种子细胞bmsc在材料上贴附和生长状况。电镜下可见β—tcp表面bmsc细胞附着,细胞排列紧密并且生长状态良好。结论bmsc可以贴附在β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,并且生长状态良好,因此可用于下一步体内植入实验。第三部分血管壁局部去交感神经对组织工程骨体内成骨效果的影响目的研究血管壁局部去交感神经对组织工程骨体内成骨效果的影响,进一步探究组织工程骨血管化、神经化与三者之间的关系。方法10只新西兰大白兔随机分为3组。于10只新西兰大白兔右桡骨构建1.5cm临界骨缺损。实验组8只:正常血管束植入组4只(组织工程骨+正常血管束),去血管外膜组(组织工程骨+局部去外膜血管束),对照组2只(仅植入组织工程骨),组间做好标记。术后12周取材,行大体观察、x线片、显微ct、四环素钙黄绿素荧光双标、vg染色等处理。检测组织工程骨体内成骨的效果。结果大体观察:血管移植组和去血管外膜组骨缺损断端已经愈合,组织工程骨支架材料在缺损部位的表面不可见;而对照组中组织工程骨支架材料仍旧清晰可见,骨缺损的断端愈合情况较差。x线片:与对照组相比血管移植组和去血管外膜组x线片中的材料影已经变得模糊不清甚至可以观察到骨髓腔的再通,但血管移植组和去血管外膜组之间并没有观察到肉眼可见的差异;对照组β-tcp材料阴影仍旧明显,可轻易辨认出材料的轮廓。显微ct:1.标本三维重建:血管移植组和去血管外膜组红色的成骨区域要远大于对照组的红色成骨区域;而血管移植组和去血管外膜组蓝色材料残留的区域要明显小于对照组材料的残余量。去血管外膜组和正常血管组无肉眼可见的差别。2.三组材料的新生骨体积分数BVF:血管移植组和去血管外膜组与对照组相比成骨量明显增多,差异具有统计学意义(p<0.05),但是血管移植组和去血管外膜组成骨量之间的差异没有统计学差异(p>0.05)。3.三组材料剩余体积比例:血管移植组和去血管外膜组与对照组相比材料残余量明显减少差异具有统计学意义(p<0.05),但是血管移植组和去血管外膜组材料的残余量之间的差异不具有统计学意义(p>0.05)。四环素和钙黄绿素荧光双标实验:矿物沉积率MAR:血管移植组和去血管外膜组比对照组矿物沉积率MAR明显增高差异具有统计学意义(p<0.05),但血管移植组和去血管外膜组材料的矿物沉积率MAR之间没有统计学差异。VG染色:与对照组相比血管移植组和去血管外膜组红色成骨区域的面积要明显大于对照组的成骨区域面积。且血管外膜移植组和去血管外膜组没有肉眼可见的明显差异。结论去交感神经血管束和正常血管束植入组织工程骨内12周与单纯组织工程骨相比均具有显著促进组织工程骨体内成骨的作用,且两者促成骨作用无统计学差异。