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由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪腹泻给世界养猪业造成了巨大的经济损失,该病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、甲型冠状病毒属,基因组为单股正链RNA,大小约28kb,共编码16个非结构蛋白(nsp1~nsp16),4个结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)及一个辅助蛋白ORF3。在病毒的感染过程中,宿主细胞能够产生多种抵抗病毒入侵的分子,包括干扰素(Interferon,IFN),促炎性细胞因子以及趋化因子等。干扰素及其诱导的干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)是宿主抗病毒感染的重要防御机制,但病毒往往进化出各种策略拮抗宿主干扰素的抗病毒作用,从而达到感染宿主并致病的目的。已有研究证实PEDV具有抑制Ⅰ型IFN产生和信号转导的能力,但对其编码的nsp7蛋白在其中的作用尚不清楚。鉴于此,本论文以PEDV nsp7为研究对象,开展了以下研究:1.PEDV nsp7抑制ISRE启动子活化和ISGs的产生PEDV可以感染不同年龄段的猪,因此其免疫逃逸策略的研究十分值得我们关注。而许多病毒拮抗IFN的免疫应答多是凭借其编码产生的蛋白实现的。因此,本研究筛选了参与抑制ISRE启动子活化的PEDV编码蛋白,结果显示,nsp7能够显著抑制IFN-α介导的ISRE启动子活化,且其抑制效果呈明显的剂量依赖性。同时,荧光定量PCR实验证实PEDV nsp7能够显著抑制ISG15、ISG54及ISG56在mRNA水平上的表达。2.PEDV nsp7不影响JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2磷酸化和ISGF3的形成许多病毒在进化过程中形成多种策略来扰乱Ⅰ型IFN的信号转导。Western blot实验显示,PEDV nsp7不影响JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的蛋白表达以及磷酸化水平,同时对STAT1/STAT2/IRF9三者组成的复合物ISGF3的形成也没有影响,但是可以显著抑制ISGF3复合物诱导的ISRE启动子活化,并且与ISGF3间存在相互作用。ISGF3的入核是ISGs产生的必须环节。PEDV nsp7不影响STAT1、STAT2的表达与磷酸化及ISGF3复合物的形成,但却抑制ISGF3诱导的ISRE启动子活性,那么它是否会影响STAT1、STAT2的入核呢?我们分别进行间接免疫荧光实验和胞质胞核分离实验进行检测,结果显示,PEDV nsp7能够显著抑制STAT1、STAT2、IRF9的核转运。3.PEDV nsp7与KPNA1竞争性结合STAT1,阻碍ISGF3核转运由于PEDV nsp7明显地抑制STAT1、STAT2、IRF9的入核,且PEDV nsp7与ISGF3复合物存在相互作用,推测PEDV nsp7的抑制效果可能是通过与STAT1、STAT2或IRF9相互作用实现的。通过免疫共沉淀实验我们得出结论,PEDV nsp7与IRF9间不存在相互作用,但可与STAT1、STAT2发生互作,且特异性结合STAT2的DBD结构域,此结构域在STATs蛋白家族中同源性较高,存在非典型的NLS序列,是ISGF3复合物被核转运蛋白KPNA1识别的关键氨基酸序列。鉴于此,我们利用CO-IP实验检测nsp7是否影响KPNA1与STAT1的结合。结果表明,随着nsp7转染量的增加,KPNA1与STAT1间的互作逐步减弱,因此,PEDV nsp7通过与KPNA1竞争性结合STAT1,抑制KPNA1对STAT1的识别,从而特异性阻碍了ISGF3核转运。4.PEDV nsp7负调控Ⅰ型IFN信号转导与nsp8无关已有研究表明,猫冠状病毒nsp7/nsp8复合物晶体结构呈现2:1的异源三聚体形式,与nsp7的结合可增强nsp8的RNA聚合酶活性;SARS冠状病毒中nsp7/nsp8以8:8的形式组成十六聚体,能够显著增强nsp8具有的RdRp活性且具有引物延伸能力。那么,nsp7对JAK-STAT信号通路的抑制作用是否与nsp8相关呢?我们将nsp7、nsp8单独转染或者以不同比例共转染于HEK-293T细胞,收样后利用双荧光素酶报告系统进行分析,结果显示nsp8本身不诱导ISRE启动子活化,且nsp7对ISRE启动子活性的抑制作用不依赖于nsp8。