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糖尿病是严重威胁人类健康的常见疾病。据统计,目前全球糖尿病患病人数超过3亿,预计在2035年,总发病人数将达到6亿人。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是最常见的糖尿病心血管并发症之一,是独立于心脏瓣膜病、高血压、冠状动脉疾病而独立存在的心脏损伤。临床表现为早期的舒张功能障碍,晚期的收缩功能障碍以及心肌重构,并最终进展至终末期心功能不全。糖尿病心肌病发病机制复杂,其中,心肌细胞Ca2+离子稳态的异常以及肌小节结构损伤是糖尿病心肌病心功能不全的重要原因。一方面,糖尿病会导致肌浆网Ca2+ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)和钠钙交换体(Na+-Ca2+ exchanger, NCX)表达和功能下降,舒张期胞浆内Ca2+清除延迟,肌浆网Ca2+回收功能下降,Ca2+储备减少,Ca2+瞬变幅度下降。另一方面,糖尿病还会引起心肌细胞基本收缩单位-肌小节结构和功能变化,比如横桥结合与解离异常,肌动蛋白构型改变以及排列紊乱等。上述变化最终会引起心肌细胞电兴奋-收缩偶联异常,并进而导致糖尿病心功能不全。Rho激酶(Rho kinase, ROCK)是小G蛋白家族中RhoA蛋白下游的效应分子。RhoA/ROCK信号通路的激活与多种心血管疾病密切相关。其中,RhoA/ROCK活性增高是导致糖尿病心脏收缩与舒张功能异常的重要原因,但是相关的机制仍有待进一步研究。近来,本课题组研究发现ROCK抑制剂法舒地尔能够改善缺氧诱导的Ca2+瞬变幅度的下降以及肌浆网Ca2+储备的减少,暗示了RhoA/ROCK信号通路可能参与了心肌细胞Ca2+转运的调控。但是在糖尿病动物模型中,抑制RhoA/ROCK活性能否调控Ca2+转运并进而改善糖尿病心功能不全目前尚不明确。另一方面, 在糖尿病心肌细胞中, 肌动蛋白构型变化以及排列紊乱是导致肌小节收缩功能障碍的重要原因,那么,抑制RhoA/ROCK信号通路能否改善肌动蛋白重构而缓解糖尿病心功能不全,仍有待进一步明确。在本研究中,我们选择临床广泛使用的ROCK抑制剂-法舒地尔作为干预药物来抑制糖尿病大鼠心脏组织中ROCK活性,从在体和单个心肌细胞水平上观察法舒地尔对糖尿病心肌病的保护作用。随后,通过检测各组间Ca2+瞬变以及肌动蛋白构型变化,来明确法舒地尔对糖尿病心肌病的保护机制,并在此基础上对相关的信号通路进行探讨。第一部分Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病大鼠心功能不全及钙稳态异常的作用目的探讨法舒地尔对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心功能不全和钙稳态异常的作用方法雄性8周龄Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病动物模型,对照组腹腔注射等量的枸橼酸钠。造模1周后,将糖尿病大鼠按照血糖和体重配对,随机分为2组,法舒地尔干预组(10mg/kg/d)和糖尿病组。分组后继续治疗8周。采用超声心动图及血流动力学检测在体心功能。分离左心室单个心肌细胞,记录单个心肌细胞的功能变化。以Fura-2为指示剂,用细胞钙成像系统检测心肌细胞钙瞬变。用咖啡因诱导钙瞬变的方法,间接评估钠钙交换体功能以及肌浆网钙储备水平。Western blotting半定量分析钙离子转运蛋白表达以及相应信号通路磷酸化水平变化。结果与正常对照组相比,糖尿病大鼠心脏组织RhoA和ROCK活性明显增高,并且表现出心功能不全和单个心肌细胞功能障碍,心肌细胞钙瞬变幅度下降,舒张期胞浆内钙离子清除延迟,肌浆网钙储备减少,NCX功能下降。与功能学变化相对应的是,糖尿病大鼠心脏组织中钙离子转运相关蛋白SERCA2、NCX、p-PLB、 p-Akt表达下降,PLB和p-PKCβ2表达增高。法舒地尔干预后,能够显著抑制RhoA和ROCK活性,改善糖尿病大鼠心功能不全和单个心肌细胞功能障碍,加快糖尿病心肌细胞舒张期胞浆内钙离子清除,缓解NCX功能,纠正SERCA2、NCX、 p-PLB、PLB、p-Akt和p-PKCβ2表达。但是法舒地尔对糖尿病引起的心肌细胞钙瞬变幅度的下降和肌浆网钙储备的减少无明显改善。结论法舒地尔通过抑制RhoA/ROCK活性,对糖尿病大鼠心脏组织具有保护作用。其对于舒张功能的改善可能是通过调节钙离子转运蛋白表达及活性,从而加快胞浆内钙离子清除而实现的。第二部分Rho激酶抑制剂法舒地尔对糖尿病大鼠心脏肌动蛋白重构的影响目的探讨法舒地尔在糖尿病心脏组织肌动蛋白构型变化中的作用方法雄性8周龄Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素70mg/kg,建立1型糖尿病动物模型,正常对照组腹腔注射等量的枸橼酸钠。造模1周后,将糖尿病大鼠按照血糖和体重配对,随机分为2组,法舒地尔干预组(1 Omg/kg/d)和糖尿病组。8周后,取心脏标本,冰冻切片行鬼笔环肽染色,激光共聚焦显微镜观察F-actin排列情况。超速离心法分离G-actin和F-actin。石蜡包埋切片行masson染色,评估左心室纤维化水平。Western blotting半定量分析肌动蛋白构型变化和α-SMA表达变化。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠心脏组织中F-actin排列紊乱,G-actin/F-actin比值下降,心脏间质纤维化明显,a-SMA表达增高。法舒地尔干预后,能有效恢复糖尿病心脏组织中F-actin排列,纠正G-actin/F-actin比值,抑制心肌间质纤维化和α-SMA表达。结论法舒地尔能够有效恢复糖尿病心脏组织中F-actin排列,改善肌动蛋白构型变化,抑制心肌间质纤维化,这可能是其改善糖尿病心肌病收缩与舒张功能障碍的部分机制。