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落叶松毛虫(Dendrolimus superans Butler)又称西伯利亚松毛虫,隶属鳞翅目枯叶蛾科,是我国北方针叶树重要的食叶害虫之一,经常周期性爆发成灾,给林业生产带来严重的损失。目前有关落叶松毛虫的研究主要集中在生活习性、预测预报、化学防治、生物防治、物理机械防治以及诱导抗性选育等方面,而关于落叶松毛虫酶学及生化毒理学的研究尚未见报道。本文从生物化学角度系统分析了乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶在落叶松毛虫6龄幼虫体内的分布特征,通过正交试验建立了落叶松毛虫幼虫乙酰胆碱酯酶的最佳反应条件；比较了落叶松毛虫幼虫5种酶对几种常用农药原药及制剂的敏感性,分析了杀虫剂处理后其体内5种酶活性的变化规律。通过离心、硫酸铵沉淀、离子交换层析、亲和层析等方法对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶进行了纯化,并对纯化前后羧酸酯酶的酶学性质进行了研究,其结果为高效、低残留、环境友好型杀虫剂的筛选及落叶松毛虫生化毒理学研究提供理论依据。1、通过正交试验设计,分析了酶浓度、底物浓度、反应时间、反应温度及pH值等因素对落叶松毛虫乙酰胆碱酯酶活性的影响,最终确定落叶松毛虫乙酰胆碱酯酶反应的最佳条件为酶液质量浓度0.2g/mL、底物浓度0.8mmol/L、反应体系pH7.5、水浴温度35℃和反应时间5min；2、落叶松毛虫6龄幼虫头部、中肠、脂肪和表皮4个组织中AChE、CarE、 GST、SOD及CAT活性的分布特征为：AChE分布相对比较均匀,其中脂肪体中的含量略高于其它组织,占躯体的29.01%,而表皮含量略低于其它组织,占21.16%；CarE主要集中在中肠,占躯体的61.31%,头部分布最少,仅占躯体的6.37%；GST则主要分布在脂肪体中,占躯体的36.15%,头部分布最少,仅占躯体的6.58%；头部的SOD含量最多,占躯体的39.79%,表皮最少,占15.30%；CAT头部含量最少,仅占躯体的3.66%,脂肪体中含量最多,占38.17%；3、测定了农药原药和制剂对落叶松毛虫6龄幼虫5种酶离体活性的影响,其结果显示：在杀虫剂制剂中,2种有机磷(敌敌畏和辛硫磷)对落叶松毛虫幼虫AChE离体活性抑制程度显著强于其它制剂,其抑制中浓度分别为1.050×10-9,7.144×10-8mg/mL;辛硫磷、敌敌畏对落叶松毛虫幼虫CarE离体活性抑制作用最强；敌敌畏制剂对落叶松毛虫幼虫GST抑制作用最强(IC50=8.737×10-6mg/mL),其次为高效氯氟氰菊酯制剂(IC50=7.174×10-3mg/mL);高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯杀虫剂制剂对落叶松毛虫SOD活性抑制性最强,其IC50分别为1.879×10-1和6.115×10-1mg/mL,敌敌畏和辛硫磷对SOD离体活力抑制程度最弱,在质量浓度低于0.05mg/mL时表现为诱导激活作用；灭幼脲和阿维菌素对CAT活性抑制最强,IC50分别为2.233mg/mL和7.672mg/mL。在供试农药原药中,2种有机磷原药(敌敌畏、氧化乐果)对落叶松毛虫幼虫AChE离体活性抑制程度显著强于其它原药及制剂,其抑制中浓度分别为4.762×10-3mg/mL和2.369×10-3mg/mL;敌敌畏、氧化乐果对落叶松毛虫幼虫CarE离体活性抑制作用最强；2种拟除虫菊酯类原药(百树菊酯和高效氯氟氰菊酯)对落叶松毛虫幼虫GST离体抑制作用最强；高效氯氟氰菊酯对离体SOD活性的抑制作用最强,而吡虫啉最弱；阿维菌素和高效氯氟氰菊酯对离体CAT活性的抑制作用最强,氧化乐果抑制力最弱。4、利用点滴法低剂量农药原药和制剂处理落叶松毛虫6龄幼虫敏感品系,研究了供试昆虫体内AChE、CarE、GST、SOD和CAT5种酶活性的变化与处理时间的关系。结果表明,原药与制剂处理落叶松毛虫6龄幼虫后体内5种酶活性均发生了相应变化,且存在显著的时间效应,但处理时间与酶的比活力并非呈线性关系。在同一时间点,杀虫剂的种类、作用机理、杀虫剂作用时间与5种酶的比活力密切相关。5、采用硫酸铵沉淀、凝胶层析和亲和层析等方法分离纯化了落叶松毛虫6龄幼虫体内的AChE和CarE,并比较分析了粗酶液和纯化CarE的生化特性。结果表明,60%硫酸铵沉淀、Sephadex G-25凝胶层析、Procainamide与CEA亲和层析能够将落叶松毛虫幼虫AChE从杂蛋白中较好的纯化,但60%硫酸铵沉淀和Sephadex G-25凝胶层析纯化效率较低,纯化倍数分别为1.645和11.297倍。CEA亲和层析纯化效果好于Procainamide亲和层析,其纯化后的比活力达162.866μmol/min-mg protein,纯化的倍数为115.344倍,回收率为16.510%。利用硫酸铵梯度沉淀、凝胶层析、DEAE纤维素离子交换层析和羟基磷灰石亲和层析等技术纯化了落叶松毛虫6龄幼虫CarE,得到纯化倍数为138.348倍,回收率为2.782%的目的蛋白CarE,通过SDS-PAGE估算其分子量约为84.78kD。以a-NA和p-NA为底物,经动力学分析落叶松毛虫幼虫粗酶液CarE的Km值分别为8.601×10-5和3.775×10-4mol/L,是纯化酶液的1.989和2.337倍,而CarE纯化酶液的Kcat分别为5.824×101和2.306×102min-1,是粗酶液的106.084和135.012倍；落叶松毛虫6龄幼虫粗酶液和纯化酶液离体CarE对敌敌畏、阿维菌素、高效氯氟氰菊酯均较敏感。敌敌畏对CarE活性抑制作用最强,其对纯化酶液CarE的ICso为1.105×10-4mg/mL,是粗酶液33.394倍,而阿维菌素和高效氯氰菊酯对粗酶液CarE的IC50分别为1.259×10-2和4.529×10-1mg/mL,是纯化酶液的1.228和23.214倍。