体外研究表明，缺氧促进肿瘤细胞的侵袭和转移与Notch信号有关。为了探讨结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号与肿瘤体内生长的关系，本研究构建了特异性阻断缺氧细胞中Noah信号的DOG融合蛋白表达载体。论文主要涉及以下内容，首先，分别构建了DNMAMLl-GFP、 ODD-DNMAMLl-GFP(ODG)和DNMAML l-ODD-GFP(DOG)三种不同的融合蛋白表达载体。其次，将上述融合蛋白表达载体转入293T人胚肾细胞，借助荧光显微镜，观察不同融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达，发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境。然后，通过逆转录病毒介导DOG融合蛋白在CT26结肠癌细胞中表达，借助荧光显微镜观察荧光强度，应用Western印迹和实时荧光定量PCR(real-time fluorogenticquantitative-PCR,RFQ-PCR)等方法验证DOG融合蛋白对缺氧的依赖性和抑制Notch信号的能力。最终，通过失巢凋亡实验和小鼠体内肿瘤形成实验，探讨了DOG融合蛋白对CT26结肠癌细胞的生物学作用。　　 1．成功构建了DNMAMLl-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体　　 酶切和测序结果表明，构建DNMAMLl-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体获得成功。　　 2．DOG融合蛋白在缺氧的293T细胞中表达增强　　 因为DNMAML1、ODD和GFP为融合蛋白，故293T细胞中绿色荧光的强弱可以初步反映融合蛋白表达量的多少。荧光显微镜下观察DNMAMLl-GFP、DOG、ODG---种融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达情况，结果发现DOG融合蛋白在缺氧细胞中的表达明显增强。　　 3．在结肠癌细胞(CT26)中DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧条件　　 成功获得逆转录病毒感染的CT26稳定细胞系(MID-DOG/CT26和MID-GFP/CT26)。在荧光显微镜下观察，发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境，Western印记法同样表明DOG融合蛋白只在缺氧的CT26细胞中存在。　　 4．DOG融合蛋白特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号　　 利用RFQ-PCR检测Notch信号下游靶基因Hesl mRNA的表达水平。与GFP对照相比，DOG融合蛋白对正常CT26细胞中Hesl mRNA水平无明显影响，该蛋白显著降低缺氧CT26细胞中Hesl mRNA水平(P<0.01)。上述结果表明，DOG融合蛋白能够特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号。　　 5．DOG融合蛋白促进缺氧的CT26细胞体外的失巢凋亡　　 与对照相比，DOG融合蛋白对正常CT26细胞的失巢凋亡没有明显影响，却促进缺氧CT26细胞的失巢凋亡（P<0.01）。　　 6．DOG融合蛋白抑制CT26细胞在BALB/c小鼠体内生长　　 体内成瘤实验表明，与GFP对照蛋白相比，DOG融合蛋白抑制CT26细胞在小鼠体内成瘤；小鼠接种MID-DOG/CT26细胞21天后，肿瘤组织的质量明显低于MID-GFP/CT26对照组（P<0.01）。　　 通过上述结果，我们得出以下结论：DOG融合蛋白特异性阻断缺氧CT26细胞中的Notch信号；结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号促进肿瘤体内生长。