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第一部分SIRT1/PGC-1α在肾小球足细胞线粒体功能障碍的作用机制
目的线粒体不仅为生物体提供能量,也可产生有基因调节、信号传递作用的活性氧化物(ROS)。线粒体发生功能障碍造成细胞代谢紊乱,促使细胞调亡。本文借助体外培养小鼠肾小球足细胞系(MPC5)构建嘌呤霉素(PAN)导致小鼠肾小球足细胞线粒体功能障碍模型及他克莫司(FK506)模型保护后,通过观察足细胞形态结构和数量、凋亡率、线粒体膜电位及线粒体超微结构的变化;线粒体功能障碍相关SIRT1/PGC-1α蛋白及mRNA的表达变化,通过研究SIRT1/PGC-1α因子在肾小球足细胞线粒体功能障碍中的作用机制,为肾小球疾病临床干预提供理论依据。
方法体外培养足细胞系(MPC5)并设计实验:分为三组即对照组、PAN组和FK506组。三组细胞用纯RPMI1640饥饿12小时,对照组用含有0.02%DMSO的RPMI1640培养液,PAN组加入终浓度为50ug/ml的PAN,FK506组先予5ug/ml的FK506孵育1h,随后更换终浓度为50ug/mlPAN和5ug/mlFK506的0.02%DMSO的RPMI1640培养液。细胞经过8h,24h和48h处理后,用倒置显微镜(×200)观察各组足细胞的形态变化并拍照记录后相关软件分析各组细胞的形态及胞体面积的变化;通过流式细胞仪检测和分析各组足细胞的凋亡率;细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)流式检测各组足细胞线粒体膜电位的变化;使用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测各组足细胞内SIRT1、PGC-1αmRNA的表达水平;使用Westernblot检测SIRT1/PGC-1α的蛋白表达水平;采用透射电镜观察各组细胞线粒体结构。
结果①对照组足细胞在各时间点(8h、24h、48h)结构形态清晰、胞体饱满、足突较多突起,细胞紧密连接,PAN组在PAN刺激后,各时间点(8h、24h、48h)细胞的胞体比对照组缩小明显(P<0.05),随着时间的延长,足突回缩甚至消失,细胞形态结构异常,细胞之间的连接松散。FK506组在FK506干预后,各时间点(8h、24h、48h)细胞的胞体较PAN损伤组的胞体相比明显增大,差异均有统计学意义(P<0.05),足细胞的形态和结构也趋于正常,细胞之间排列紧密。②采用AnnexinV-FITC/PropidiumIodide(PI)双染法检测各组足细胞凋亡率的变化,结果显示:对照组各时间点(8h、24h、48h)细胞的凋亡率都处于较低数值。PAN组细胞的凋亡率与对照组比较,各个时间点都显著升高(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。FK506组在FK506干预后,足细胞的凋亡率与PAN损伤组比较,各个时间点都显著降低(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。③细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)流式检测各组足细胞线粒体膜电位的变化,结果显示:对照组各时间点(8h、24h、48h)线粒体膜电位处于较高值,提示细胞正常。PAN组线粒体膜电位与对照组比较,各个时间点都显著下降(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05),提示细胞早期调亡。FK506组在FK506干预后,线粒体膜电位与PAN损伤组比较,各个时间点都显著上升(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05),提示细胞逐渐回复正常。④实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示,PAN组在各时间点(8h、24h、48h)SIRT1、PGC-1αmRNA较对照组均明显下降,差异均有统计学意义(P均<0.05),FK506组在各时间点(8h、24h、48h)SIRT1、PGC-1αmRNA较PAN损伤组均明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑤Westernblot结果显示,PAN组细胞的SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平较对照组下降,切呈时间依赖关系,随着时间的延长,表达量逐渐下降,差异均有统计学意义(P均<0.05)。FK506组SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平在各个时间点(8h、24h、48h)较PAN组明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑥通过透射电镜观察线粒体形态结构及数量变化的结果显示,对照组足细胞在各时间点(8h、24h、48h)结构形态清晰、呈棒状,饱满规则,线粒体嵴清晰且排列整齐,在细胞质中分布较多。PAN组在PAN刺激后,线粒体变圆变大,嵴变少变短甚至消失。FK506组在FK506干预后,线粒体的形态和结构也趋于正常。
结论PAN可导致细胞线粒体损伤,致使线粒体功能障碍,引起足细胞的损伤、调亡;FK506可抑制线粒体功能障碍,维护线粒体正常的形态结构,修复损伤的足细胞;SIRT1/PGC-1α蛋白的稳定表达在肾脏病的发生发展中发挥重要作用,可作为肾脏疾病治疗的潜在靶点。
第二部分地塞米松通过稳定磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制嘌呤霉素诱导的足细胞凋亡研究
目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)分子信号通路在地塞米松(DEX)抑制嘌呤霉素(PAN)引起足细胞凋亡中发挥的作用。
方法:体外培养小鼠肾小球足细胞系,并设立空白对照组、溶媒溶剂二甲基亚砜(DMSO)组、PAN组、DEX组及PI3K特异性抑制剂LY294002组。采用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光染色检测CD2相关蛋白(CD2AP)mRNA及细胞内分布情况,激光共聚焦检测其与p85的共定位分布的情况;WesternBlot检测各组Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成激酶-3β(GSK3β)和磷酸化GSK3β(p-GSK3β)的表达。
结果:PAN刺激组各时间点(8h、24h、48h)CD2APmRNA(1.11±0.16、0.78±0.09、0.56±0.43)较对照组(1.90±0.26、2.09±0.12、2.28±0.95)均明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05),CD2AP蛋白均匀细丝状分布于胞质足突及核内转变为不连续粗颗粒状集中分布于核周,CD2AP与p85在细胞核膜、细胞质及细胞膜均匀的重叠转变为核内增多的强荧光信号的重叠;DEX干预组各时间点(8h、24h、48h)CD2APmRNA(1.53±0.14、2.15±0.27、2.13±0.15)较PAN刺激组(1.11±0.16、0.78±0.09、0.56±0.43)明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05),在细胞胞膜、胞质的分布密度、分布范围大于PAN刺激组,与p85其重叠荧光信号向核内积聚明显减轻;PAN刺激足细胞15m后p-Akt蛋白表达水平最低,p-GSK3β蛋白表达水平在30min最低,p-Akt及p-GSK3β蛋白表达水平呈PAN浓度依赖性下降(P<0.05),不同浓度DEX干预后p-Akt及p-GSK3β蛋白表达水平均呈DEX浓度依赖性地恢复(P<0.05),LY294002组p-Akt及p-GSK3β的表达则显著下降(P<0.01)。
结论:DEX通过稳定CD2AP的表达水平和分布情况来保护足细胞,抑制足细胞调亡;PI3K/Akt分子信号通路稳定的表达水平是DEX保护足细胞的关键因素。
目的线粒体不仅为生物体提供能量,也可产生有基因调节、信号传递作用的活性氧化物(ROS)。线粒体发生功能障碍造成细胞代谢紊乱,促使细胞调亡。本文借助体外培养小鼠肾小球足细胞系(MPC5)构建嘌呤霉素(PAN)导致小鼠肾小球足细胞线粒体功能障碍模型及他克莫司(FK506)模型保护后,通过观察足细胞形态结构和数量、凋亡率、线粒体膜电位及线粒体超微结构的变化;线粒体功能障碍相关SIRT1/PGC-1α蛋白及mRNA的表达变化,通过研究SIRT1/PGC-1α因子在肾小球足细胞线粒体功能障碍中的作用机制,为肾小球疾病临床干预提供理论依据。
方法体外培养足细胞系(MPC5)并设计实验:分为三组即对照组、PAN组和FK506组。三组细胞用纯RPMI1640饥饿12小时,对照组用含有0.02%DMSO的RPMI1640培养液,PAN组加入终浓度为50ug/ml的PAN,FK506组先予5ug/ml的FK506孵育1h,随后更换终浓度为50ug/mlPAN和5ug/mlFK506的0.02%DMSO的RPMI1640培养液。细胞经过8h,24h和48h处理后,用倒置显微镜(×200)观察各组足细胞的形态变化并拍照记录后相关软件分析各组细胞的形态及胞体面积的变化;通过流式细胞仪检测和分析各组足细胞的凋亡率;细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)流式检测各组足细胞线粒体膜电位的变化;使用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测各组足细胞内SIRT1、PGC-1αmRNA的表达水平;使用Westernblot检测SIRT1/PGC-1α的蛋白表达水平;采用透射电镜观察各组细胞线粒体结构。
结果①对照组足细胞在各时间点(8h、24h、48h)结构形态清晰、胞体饱满、足突较多突起,细胞紧密连接,PAN组在PAN刺激后,各时间点(8h、24h、48h)细胞的胞体比对照组缩小明显(P<0.05),随着时间的延长,足突回缩甚至消失,细胞形态结构异常,细胞之间的连接松散。FK506组在FK506干预后,各时间点(8h、24h、48h)细胞的胞体较PAN损伤组的胞体相比明显增大,差异均有统计学意义(P<0.05),足细胞的形态和结构也趋于正常,细胞之间排列紧密。②采用AnnexinV-FITC/PropidiumIodide(PI)双染法检测各组足细胞凋亡率的变化,结果显示:对照组各时间点(8h、24h、48h)细胞的凋亡率都处于较低数值。PAN组细胞的凋亡率与对照组比较,各个时间点都显著升高(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。FK506组在FK506干预后,足细胞的凋亡率与PAN损伤组比较,各个时间点都显著降低(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。③细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)流式检测各组足细胞线粒体膜电位的变化,结果显示:对照组各时间点(8h、24h、48h)线粒体膜电位处于较高值,提示细胞正常。PAN组线粒体膜电位与对照组比较,各个时间点都显著下降(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05),提示细胞早期调亡。FK506组在FK506干预后,线粒体膜电位与PAN损伤组比较,各个时间点都显著上升(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05),提示细胞逐渐回复正常。④实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示,PAN组在各时间点(8h、24h、48h)SIRT1、PGC-1αmRNA较对照组均明显下降,差异均有统计学意义(P均<0.05),FK506组在各时间点(8h、24h、48h)SIRT1、PGC-1αmRNA较PAN损伤组均明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑤Westernblot结果显示,PAN组细胞的SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平较对照组下降,切呈时间依赖关系,随着时间的延长,表达量逐渐下降,差异均有统计学意义(P均<0.05)。FK506组SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平在各个时间点(8h、24h、48h)较PAN组明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑥通过透射电镜观察线粒体形态结构及数量变化的结果显示,对照组足细胞在各时间点(8h、24h、48h)结构形态清晰、呈棒状,饱满规则,线粒体嵴清晰且排列整齐,在细胞质中分布较多。PAN组在PAN刺激后,线粒体变圆变大,嵴变少变短甚至消失。FK506组在FK506干预后,线粒体的形态和结构也趋于正常。
结论PAN可导致细胞线粒体损伤,致使线粒体功能障碍,引起足细胞的损伤、调亡;FK506可抑制线粒体功能障碍,维护线粒体正常的形态结构,修复损伤的足细胞;SIRT1/PGC-1α蛋白的稳定表达在肾脏病的发生发展中发挥重要作用,可作为肾脏疾病治疗的潜在靶点。
第二部分地塞米松通过稳定磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制嘌呤霉素诱导的足细胞凋亡研究
目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)分子信号通路在地塞米松(DEX)抑制嘌呤霉素(PAN)引起足细胞凋亡中发挥的作用。
方法:体外培养小鼠肾小球足细胞系,并设立空白对照组、溶媒溶剂二甲基亚砜(DMSO)组、PAN组、DEX组及PI3K特异性抑制剂LY294002组。采用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光染色检测CD2相关蛋白(CD2AP)mRNA及细胞内分布情况,激光共聚焦检测其与p85的共定位分布的情况;WesternBlot检测各组Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成激酶-3β(GSK3β)和磷酸化GSK3β(p-GSK3β)的表达。
结果:PAN刺激组各时间点(8h、24h、48h)CD2APmRNA(1.11±0.16、0.78±0.09、0.56±0.43)较对照组(1.90±0.26、2.09±0.12、2.28±0.95)均明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05),CD2AP蛋白均匀细丝状分布于胞质足突及核内转变为不连续粗颗粒状集中分布于核周,CD2AP与p85在细胞核膜、细胞质及细胞膜均匀的重叠转变为核内增多的强荧光信号的重叠;DEX干预组各时间点(8h、24h、48h)CD2APmRNA(1.53±0.14、2.15±0.27、2.13±0.15)较PAN刺激组(1.11±0.16、0.78±0.09、0.56±0.43)明显上升,差异均有统计学意义(P均<0.05),在细胞胞膜、胞质的分布密度、分布范围大于PAN刺激组,与p85其重叠荧光信号向核内积聚明显减轻;PAN刺激足细胞15m后p-Akt蛋白表达水平最低,p-GSK3β蛋白表达水平在30min最低,p-Akt及p-GSK3β蛋白表达水平呈PAN浓度依赖性下降(P<0.05),不同浓度DEX干预后p-Akt及p-GSK3β蛋白表达水平均呈DEX浓度依赖性地恢复(P<0.05),LY294002组p-Akt及p-GSK3β的表达则显著下降(P<0.01)。
结论:DEX通过稳定CD2AP的表达水平和分布情况来保护足细胞,抑制足细胞调亡;PI3K/Akt分子信号通路稳定的表达水平是DEX保护足细胞的关键因素。