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日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是我国四大养殖对虾品种之一,具有重要的经济价值。日本囊对虾幼体发育过程复杂,受精卵孵化后需要经过无节幼体,溞状幼体,糠虾幼体和仔虾4个发育阶段,发育过程中蜕皮频繁,蜕皮周期较短。近年来,随着日本囊对虾养殖规模的逐步扩大,各种细菌性疾病对其养殖业的发展造成了巨大的影响,并造成了严重的经济损失。 ML(MD-2-related Lipid-recognition)家族为一类具有保守ML单结构域的蛋白质,能够直接和脂类结合,从而参与先天免疫和脂类的识别与代谢过程。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了日本囊对虾形态变异类型Ⅰ的ML基因——MjML。该基因的cDNA全长614bp,开放阅读框长453bp,编码150个氨基酸,理论等电点为4.55,相对分子质量为15865.23Da。通过基因组PCR扩增得到1678bp的MjML的基因组序列,其中含有4个外显子与3个内含子。MjML具有6个在ML蛋白中相对保守的半胱氨酸残基,可能形成3对二硫键。同源性比对发现,MjML的氨基酸序列与凡纳滨对虾的LvML一致性最高(84.0%)。实时荧光定量PCR结果显示MjML主要在肝胰腺中表达,在心脏、血细胞、肌肉、胃、鳃、神经、肠、眼柄中表达均极微量。在日本囊对虾早期幼体发育过程中,MjML表达量在阶段性的蜕皮与变态后有大幅的升高;在仔虾期间,MjML表达量呈现阶段上升的特征。 为了进一步研究MjML基因的相关功能,本研究根据已获得的MjML的cDNA序列构建重组pET-28a-MjML质粒进行原核表达,并通过Western Blot确定为带6×His标签的重组MjML蛋白。MjML蛋白最佳诱导条件为:IPTG浓度0.1mmol/L,30℃220rpm,诱导培养6h,且重组蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。收集包涵体,经过尿素溶解变性、梯度透析法复性、过Ni柱纯化和脱盐后,得到浓度为1.02mg/mL的可溶性重组蛋白。LPS(lipopolysaccharide,细菌脂多糖)结合实验显示重组蛋白对LPS有明显的结合活性。 本论文实验研究表明,日本囊对虾早期幼体发育过程中MjML的表达量变化与肝胰腺的发育程度有一定的相关性,同时与早期幼体发育过程中的变态以及仔虾期间的蜕皮也可能有一定的关联。而重组MjML蛋白对于LPS的直接结合作用,则提示了MjML可能参与日本囊对虾识别革兰氏阴性菌的先天免疫过程。