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随着我国海水养殖与淡水养殖业的逐步扩大,水产品的安全问题越来越备受大家关注,其中由海藻产生的贝类毒素,通过食物链在海产品(例如软体贝类、虾类和鳍鱼类)体内积聚,人类食用受污染的海产品,易导致食物中毒,其中以大田软海绵酸(Okadaic Acid, OA)为主要成份的腹泻性贝毒素(DSP)引发的中毒最多,危害最大。另外药物残留问题随着海水与淡水养殖业的规模化也日益受关注,药物残留导致水产品的质量受到影响,进而威胁人类健康,影响出口贸易,药物残留问题亦成为社会关注的焦点。鉴此,本文进行了海产品中大田软海绵酸化学发光免疫分析技术的研究,并与进口ELISA试剂盒及国内相关的标准方法比较及初步应用；通过水产品禁用药物残留蛋白质芯片检测技术的研究,以期对水产品中禁用药物进行多残留检测分析。1.海产品中大田软海绵酸化学发光免疫分析技术研究(1)OA单克隆抗体的制备采用活性酯法将小分子OA与BSA和OVA进行偶联,分别作为免疫抗原和检测抗原,通过紫外分光法、SDS-PAGE、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-MS/MS)等方法对偶联产物进行鉴定,并计算OA与蛋白偶联的结合比。结果表明OA和BSA的分子结合比为4.10：1,成功制备OA的免疫抗原及检测抗原。将制备的完全抗原OA-BSA免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)融合,利用间接ELISA法筛选阳性克隆,经过3次亚克隆,筛选出3株能够稳定分泌OA单克隆抗体的细胞株,分别是4H4,4H7,5C10,其中4H4株最好,OA半数抑制质量浓度IC5o为2.15ng/mL,经DEAE纤维素柱纯化腹水,最终获得效价高于1：64000的纯化单抗。(2)OA化学发光免疫分析方法的建立利用OA4H4单抗细胞株产生的抗体和本实验室通过呋喃西林代谢产物完全抗原、抗体建立的酶促化学发光检测技术平台,建立OA酶促化学发光检测技术并初步研制试剂盒,其中单克隆抗体最佳稀释倍数为1：8×104,包被抗原最佳浓度为0.5μg/mL; OA浓度在0.08125ng/L-10ng/L范围内,B/B0值与OA浓度的对数值呈线性关系,回归方程为y=-0.2436x+0.3721(R2=0.9977), IC50%0.298ng/mL。样品检测限为1.232ng/kg,批内和批间变异系数分别为2.64%和3.14%,在样品添加浓度50μg/kg、80μg/kg、160μg/kg时,贻贝和蛤蜊肉样的回收率分别为86%-97%,85%-93%,特异性试验表明与DTXl交叉反应为50.58%,与石房蛤毒素(STX)无交叉反应。(3)与进口ELISA试剂盒及国内相关的标准方法比较及初步应用本文参考欧盟兽药残留分析标准,从试剂盒灵敏度、准确度、精确度等指标对自制试剂盒和进口试剂盒进行比较,与进口试剂盒(BRAXIS)相比,灵敏度更高,精确度和准确度与进口试剂盒水平相当,样品前处理过程更简单、快速,两种试剂盒对9份实际样品的检测结果具有较好的相关性；与国内标准方法液相色谱-串联质谱法(LC-MS)(SC/T2269-2009)标准方法相比,自制试剂盒可对最低添加浓度2.5μg/kg的样品能进行有效检测,而LC-MS的检测限为100μg/kg,两者添加回收率在添加浓度为100-800μg/kg时,数值接近。运用自制试剂盒对125份实际样品检测,其中阳性样品43份,对于浓度值大于100μg/kg的样品,自制试剂盒与LC-MS(SC/T2269-2009)法检测的结果具有较好的相关性,结果表明本实验室自制试剂盒能够满足我国进出口海产品中OA限量检测的需要。2.水产品中禁用药物残留蛋白质芯片检测技术的研究本研究合成了氨基无色孔雀石绿(NH2-LMG)、已烯雌酚-单-羧基丙基-醚(DES-MCPE)、MPA-3-(O-羧甲基)肟、3-氨基-2-恶唑烷酮-4-羧苯基肟(CPAOZ)四种物质。与载体蛋白BSA (RSA)、OVA偶联分别得到了免疫抗原与包被抗原。运用杂交瘤单抗制备技术获得4种药物的单克隆抗体,将4种药物的包被抗原点样于环氧基基片制备蛋白芯片,利用间接竞争抑制原理和LuxScan10K-B型共聚焦扫描仪建立检测体系,最终建立水产品中主要禁用药物残留蛋白芯片技术。并对其主要参数进行研究,该技术中LMG、MPA, DES, AOZ的IC50分别为19.7ng/mL,3.8ng/mL,9.6ng/mL,0.374ng/mL.对应的检测灵敏度分别为5.95ng/mL、1.30ng/mL、1.97ng/mL、0.286ng/mL。MPA, DES, AOZ检测灵敏度已达到检测违禁药物的要求。虾肉样和鱼肉样品中添加LMG、MPA, DES的回收率为48.7%-94.5%。经初步实际应用结果表明本研究的水产品中主要禁用药物残留检测技术,可达到快速、高通量、精确定量要求。