【摘 要】
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多聚半乳糖醛酸酶是在果实成熟特定阶段导致细胞壁降解的主要因素,从而在果实成熟软化过程中起重要作用.该文以加工番茄"87-5"为材料,采用异硫氰酸胍法提了提取出总RNA,然后
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多聚半乳糖醛酸酶是在果实成熟特定阶段导致细胞壁降解的主要因素,从而在果实成熟软化过程中起重要作用.该文以加工番茄"87-5"为材料,采用异硫氰酸胍法提了提取出总RNA,然后用磁性分离技术分离纯化mDNA,利用反转录PCR(RT-PCR)技术,特异性扩增出加工番茄PG基因的cDNA,用琼脂糖凝胶电泳鉴定其大小.通过电泳,扩增产物大小约为1.5kb,与已报导的PG基因的cDNA大小相符,初步断定该PCR产物是所要扩增基因的cDNA.将此cDNA与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞.通过抗性筛选、蓝白斑筛选、PCR鉴定、酶切鉴定等进一步地确证,证明确实为要克隆的基因.由于该基因序列太长(1.5kb),超出了目前测序所能测出的最大长度,为获得全长序列制作一个1kb的亚克隆.用T7和SP6两个通用引物分别对克隆在pGEM-3Z上的一个亚克隆和pGEM-T上的重组子进行正反向测序,通过重叠序列的拼接,得到了完整的PG基因的cDNA序列.用用BAMHI/SAII双酶切PGCDNA质粒中间载体PBLEGC和PBIN48质粒,分别进行琼脂糖电泳并回收产物,再进行连接反应,构建了两个反义表达载体.该研究首次成功地克隆了加工番茄多聚半甩糖醛酸酶(PG)基因的CDNA,并进行了序列测定及反义表达载体的构建.该研究在RNA提取方法上和反转录PCR方法上也进行了改进.
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