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糖尿病已经成为威胁人类健康的最重要的疾病之一,胰岛素作为治疗糖尿病的最常用药物其研究一直是生物医药领域的热点。门冬胰岛素是近年来新开发的胰岛素类似物,与传统的人胰岛素相比,门冬胰岛素控制血糖的效果显著,起效快,副作用少,是市场上最常用的速效胰岛素药物。目前关于门冬胰岛素下游纯化工艺的报道不多,本文利用富进生物医药有限公司提供的门冬胰岛素前体,成功建立了门冬胰岛素生产的下游纯化工艺,简化了胰岛素生产下游过程的操作步骤,提高了工作效率。首先,利用Ni Sepharose和SP Sepharose提取纯化门冬胰岛素前体,去除了发酵带来的大部分色素,提高了门冬胰岛素前体的纯度与浓度。在此基础上,研究确立了使用Lys-C酶对门冬胰岛素前体进行酶切的工艺和条件,一次性去除了门冬胰岛素前体的信号肽与C肽,得到了中间体DesB30,并与使用胰蛋白酶对于门冬胰岛素前体进行酶切的效果进行了对比。其次,在得到门冬胰岛素纯化过程中间体DesB30后,研究使用苏氨酸甲酯与苏氨酸叔丁酯对于DesB30进行转肽,建立了两种苏氨酸酯的转肽条件并进行比较,明确了使用苏氨酸甲酯进行门冬胰岛素转肽的优点,并研究了温度对于门冬胰岛素使用苏氨酸甲酯进行转肽的影响。转肽完成后,使用RP-HPLC对转肽产物进行纯化,研究了几种反相纯化的条件与参数,并将门冬胰岛素酯的纯度提高到97%以上。然后,针对门冬胰岛素叔丁酯,使用三氟乙酸除去苏氨酸上的保护基团叔丁基,再用旋转蒸发的办法除去三氟乙酸;对门冬胰岛素甲酯,研究了不同pH条件对于门冬胰岛素甲酯脱保护的影响并确立了脱保护条件,同时研究创立了使用Q Sepharose对于门冬胰岛素甲酯的柱上脱保护方法。待门冬胰岛素酯脱保护完成转变成成熟的门冬胰岛素后,使用RP-HPLC对制得的门冬胰岛素进行纯化,提高门冬胰岛素的纯度至98%以上。在RP-HPLC纯化主峰的基础上,研究了pH、锌的添加比例、氯化钠以及蛋白浓度对于门冬胰岛素结晶的影响,确立了5 mg/ml门冬胰岛素、0.5 mol/L甘氨酸、0.5 mol/L氯化钠、0.2%苯酚,pH6.5,Zn与ASP摩尔比为2.5:1的结晶体系,制备了符合要求的晶型均一的门冬胰岛素晶体。实验过程中,使用HPLC与LC-MS对每一步的产物进行鉴定,确认所建立的门冬胰岛素下游纯化与制备工艺达到要求。