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胰岛素对于糖尿病,特别是胰岛素依赖性糖尿病的治疗至关重要。长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数,在糖尿病患者体内重建胰岛素基础分泌。国内外运用于临床不久的两种长效人胰岛素类似物:甘精胰岛素(Insulin Glargine)和地特胰岛素(Insulin Detemir)无明显的代谢波峰和波谷,是真正意义上的基础胰岛素,但其有效控制血糖时间仍不能超过24 h。频繁地注射胰岛素,给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦,临床上需要注射间隔时间更长的超长效胰岛素。以临床需要为前提,前人对胰岛素的结构研究为基础,应用基因工程技术构建含目的基因的重组质粒,经表达、酶切、纯化和化学修饰,有希望筛选出有效控制血糖时间达到48 h以上,不出现代谢的波峰和波谷,无需每日通过监测病人血糖浓度来调整给药量的一种新型长效人胰岛素类似物。研究目的:构建含短C肽AAK的人胰岛素原类似物DesB30(HMPIDesB30 Human Mini-proinsulin DesB30)的毕赤酵母表达系统,筛选高效分泌表达HMPIDesB30的重组毕赤酵母工程菌,获得HMPIDesB30重组蛋白。建立HMPIDesB30的制备、纯化及酶切(获得人胰岛素类似物HIDesB30, Human Insulin DesB30)的中试生产工艺。利用14 C脂肪酸、MPS(3-maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester , 3-马来酰亚胺丙酸羟基琥珀酰亚胺酯)及mPEG-SPA(methyl polyethylene glycol succinimidyl propionate,甲基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯)分别修饰HIDesB30,考察修饰后HIDesB30控制血糖的特性,以HIDesB30-14 C脂肪酸(Detemir)为参照,筛选出有效控制血糖时间超过Detemir,并达到48 h以上,不出现代谢的波峰和波谷的一种新型长效人胰岛素类似物。研究方法:①HMPIDesB30在毕赤酵母中的高效表达1)利用两种载体pPIC9K和pPICZalphaA筛选高表达菌株。HMPIDesB30/pPIC9K:首先利用pPIC9上的STE13识别位点编码碱基之前的XhoI和多克隆位点中的NotI,将HMPIDesB30插入到pPIC9中,构建重组质粒HMPIDesB30/pPIC9,然后将HMPIDesB30亚克隆到pPIC9K上的SalI和SacI之间,构建以α因子为分泌信号的重组质粒HMPIDesB30/pPIC9K;HMPIDesB30/pPICZalphaA:利用pPICZalphaA上的STE13识别位点编码碱基之前的XhoI和多克隆位点中的NotI,将HMPIDesB30插入到pPICZalphaA中,构建以α因子为分泌信号的重组质粒HMPIDesB30/pPICZalphaA。2)线性化HMPIDesB30/pPIC9K和HMPIDesB30/pPICZalphaA并电转化毕赤酵母菌株GS115。3)利用含不同浓度G418或Zeocin的平板筛选获得多拷贝重组工程菌HMPIDesB30/pPIC9K/GS115或HMPIDesB30/pPICZalphaA/GS115。4)摇瓶表达HMPIDesB30并筛选高表达菌株。5)优化发酵条件,发酵罐发酵。②HMPIDesB30的纯化及酶切发酵液经SIPI-40大孔吸附树脂、SP柱纯化后,用10-20mmol/L Zn2+沉淀,再将沉淀溶于含10-20mmol/LEDTA的25mmol/L Tris-HCl (pH 9)中。按胰蛋白酶/HMPIDesB30质量比1/500,4℃酶切过夜。③HIDesB30的化学修饰用14 C脂肪酸、MPS及mPEG-SPA分别修饰HIDesB30,并纯化修饰后的产物。④几种化学修饰HIDesB30的特性考察用几种修饰后HIDesB30腹腔注射STZ(streptozotocin,链脲菌素)致糖尿病小鼠,考察药效持续时间、药效-剂量关系。对筛选出的药效持续时间长于Detemir的修饰产物作代谢特性研究。研究结果:①16.5% Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析出HMPIDesB30的分子量与理论分子量相符,经高密度发酵,表达量可达1 g/L。②HMPIDesB30的纯化回收率可达60%,纯度可达95%。单次胰蛋白酶酶切回收率可达90%。③经14 C脂肪酸修饰的HIDesB30最大修饰率为50%,其修饰产物的分子量与具有相同结构的Detemir分子量一致,降血糖活性一致。经MPS修饰的HIDesB30最大修饰率为80%,具有降血糖活性。在不同pH条件下mPEG-SPA修饰HIDesB30可获得两种修饰产物: HIDesB30-PEG1(单分子PEG化HIDesB30)和HIDesB30-PEG2(2分子PEG化HIDesB30),最大修饰率为分别为60%和95%,均具有降血糖活性。④修饰后HIDesB30药效持续时间与剂量有关。按药效持续时间长短初步排序:HIDesB30-PEG1>Detemir> HIDesB30-PEG2>HIDesB30-MPS。⑤HIDesB30-PEG1药效持续时间超过48 h,且无代谢的波峰与波谷。结论:本研究实现了含短C肽的人胰岛素原类似物HMPIDesB30在毕赤酵母中的高效分泌表达,表达量达1 g/L,分泌表达的重组蛋白HMPIDesB30未出现糖基化,未形成二聚体和多聚体,并具有生物学活性。本研究确定了HMPIDesB30的发酵条件,克服传统的酵母分泌表达产物超滤浓缩工艺无法除去大量色素的缺点,用大孔吸附树脂代替超滤,制定的纯化工艺回收率高,终产品经质谱鉴定正确。此外,还建立了仅用胰蛋白酶单一酶切除去短C肽(形成HIDesB30)的方法和条件,对今后工业化制备和研究重组胰岛素具有重要意义。14 C脂肪酸、MPS、mPEG-SPA分别修饰HIDesB30获得的产物中,14 C脂肪酸修饰HIDesB30所得产物的分子量与具有相同结构的Detemir分子量一致,降血糖活性一致,但采用的表达系统、纯化工艺及修饰方法与Detemir相关文献报道的制备方法完全不同,且本研究所采用修饰方法的修饰率高于Detemir文献报道的方法。从几种修饰产物中筛选出单分子PEG化HIDesB30 (HIDesB30-PEG1),药效持续时间长于Detemir,达到48 h以上,无代谢的波峰和波谷,可能成为具有产业化意义的新型长效人胰岛素类似物。