论文部分内容阅读
研究背景膀胱癌在世界范围内的发病率居于所有恶性肿瘤的第九位,在我国,男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第八位,女性排在第十二位以后。近年来,随着我国工业化进程以及人群饮食结构的改变,部分城市肿瘤发病率报告显示,膀胱癌发病率有逐年增高的趋势。膀胱癌的发生是多因素、多步骤的复杂病理变化过程,既有内在的遗传因素,又有外在的环境因素。流行病学研究表明,较为明确的两大致病危险因素分别是吸烟和长期接触工业化学产品。正常膀胱细胞恶变起始于DNA及基因表达水平的改变。基于仅从膀胱癌发生机制的单因子分析模式或基因组、转录或蛋白翻译水平单一层次分析模式,不能系统地阐明膀胱癌早期发病的特点和规律,无法对早期膀胱粘膜病变的最终转归作出科学的评价与分析。随着具有大规模、高通量基因和蛋白分析的生物芯片技术平台的建立,以及生物信息学手段和方法的不断完善,使得从多因子和多层次动态分析膀胱癌的发病机制研究成为可能。同时,实时荧光定量PCR技术的发明,不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前在DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、遗传病诊断、病原体检测等方面已得到广泛应用,可以有效的对基因芯片的检测数据进行定量验证。采用流行病学病例对照研究方法,分析筛选出的基因作为一种机体本身的生物学暴露可疑危险因素,其暴露程度在膀胱癌与正常人膀胱粘膜之间的差异是否具有显著性意义,该基因的表达差异与膀胱癌的联系强度如何等等,对于判断芯片筛选结果的可靠性如何,哪些基因最具有应用价值,并进一步明确可用于膀胱癌检测的高度敏感性标志基因具有重要意义。成功筛选出膀胱癌癌变的生物分子标志谱及肿瘤标志基因,补充与膀胱癌发生相关疾病、膀胱癌发生的分子机制及膀胱癌早期病变的分子调控的流行病学研究,结合基于临床内镜的早癌诊断技术,有望成为克服现有问题和明显提高早癌珍断最有效的途径之一,并在膀胱癌筛查、诊断和治疗方面取得显著的成绩,进而对膀胱癌的临床处理和患者预后获得实质性的影响。研究目的采用全基因组芯片绘制出中国广东人群膀胱癌癌变的生物分子标志谱,研究膀胱癌发生的分子机制,筛选出肿瘤特异性差异基因,扩大样本数量采用实时荧光定量PCR技术对基因芯片筛选的结果进行验证,并采用流行病学病例对照研究方法,最终筛选出了可用于膀胱癌易感性预测、早期诊断及疾病监测,分子靶向治疗的高度敏感性肿瘤标志基因。研究方法1.标本的收集自南方医院泌尿外科取正常膀胱移行上皮组织、肌层浸润性（T2以上）膀胱癌组织各10例用于基因芯片筛选,各45例用于实时定量PCR验证。2.标本总RNA提取及质量检定采用Qiagen RNeasy微量抽提试剂盒抽提其总RNA,Agilent 2100 bioanalyzer检定标本总RNA质量。3.RNA标本的线性荧光扩增标记及质量检定采用Agilent公司生产的低样品量RNA线性扩增试剂盒进行双色荧光标记,Agilent 2100 bioanalyzer检定标记好的cRNA质量。4.70mer寡核苷酸芯片的制备、基因芯片杂交、扫描检测用Cartesian Pixsys 5500基因芯片打印仪点样Qiagen 70mer寡核苷酸探针制备芯片,将上述标记好的样品共10组,分别与制备好的基因芯片进行杂交,采用Axon Genepix 4000A基因芯片扫描仪进行杂交结果的扫描,Genepix pro6.0软件数据分析。5.芯片杂交结果的聚类分析采用Cluster软件进行系统聚类分析,并采用JavaTreeview软件显示浸润性膀胱癌与正常膀胱移行上皮组织的基因表达谱差异。6.差异基因的Panther Pathway分析采用Panther数据库对上述筛选到的共同表达上凋以及下调基因所涉及到的信号通路进行检索分析。7.差异基因的实时荧光定量RT-PCR检测采用Qiagen Rotor-Gene SYBR GreenRT-PCR试剂盒设置PCR反应,并用Rotor Gene 6000实时荧光定景PCR仪进行扩增检测,验证了筛选出的6个膀胱癌表达上调基因。8.膀胱癌基因易感性的流行病学研究8.1采用病例对照研究显著性检验（x2检验）比较病例组与对照组对待测的6个基因的暴露比例是否有显著性差异,并判断这些基因的高表达是否与膀胱癌的发生有统计学联系;8.2通过比值比（OR）分析,获得病例组与对照组暴露比值之比,从而反映基因高表达因素与膀胱癌之间的联系强度。并进一步采用Miettinen法估计OR的95%可信区间。研究结果1.采用70mer全基因组寡核苷酸基因芯片,对10对浸润性膀胱癌标本及正常膀胱移行上皮的19568个基因的表达谱差异同时进行了研究,共有7839个有效表达的基因,总共筛选到差异表达基因152个,其中上调基因70个,已知与肿瘤发生相关的基因23个;下调基因82个,已知与肿瘤发生相关的基因17个。2.经过Panther数据库检索发现,上调的70个基因中,涉及已知的37条信号通路,下凋的82个基因,涉及已知的32条信号通路,其中包括已知直接与膀胱癌相关或与肿瘤发生相关的通路。3.所选出的研究的6个基因中,FASN、STMN1、TYMS、VEGF、KRT19五个基因x2值分别为51.61,51.61,71.43,61.95,64.21,远大于x20.01（1）=6.63,因此判定这些基因在膀胱癌与正常膀胱粘膜间的基因表达水平均存在显著性差异。验证了基因芯片检测的结果。其中TYMS基因与VEGF基因的高表达与膀胱癌发生的联系强度更高,其比值比（OR值）分别高达451和238.86。结论1.本研究采用70mer全基因组寡核苷酸基因芯片,对10对浸润性膀胱癌标本及正常膀胱移行上皮的19568个基因的表达谱差异同时进行了研究,获得了广东人膀胱癌癌变的生物分子标志谱,共筛选到肿瘤差异表达基因152个,涉及已知的多条信号通路,包括已知直接与膀胱癌相关或与肿瘤发生相关的通路。充分证明浸润性膀胱癌的发生是一个涉及多基因、多步骤、多通路调控的复杂过程。所获得的膀胱癌癌变的生物分子标志谱及筛选出的肿瘤标志基因,对于研究广东人膀胱癌发生的分子机制及膀胱癌的临床早期诊疗具有重要意义。2.通过扩大样本量,采用实时荧光定量PCR方法,对芯片检测的FASN、STMN1、SPINT2、TYMS、VEGF、KRT196个表达上调基因的表达情况进行了定量分析,采用流行病学病例对照研究方法进行研究,对基因芯片筛选的结果进行了验证,并最终筛选出了与膀胱癌发生密切相关的高度敏感性肿瘤标志基因TYMS和VEGF,这些基因不仅可以用于膀胱癌的易感性预测、早期诊断及疾病监测,对于其分子靶向治疗的开展也具有重要的指导意义。3.主要存在的问题是膀胱癌在广东人中发病率相对较低,收集调查病例样本数不够大,全基因组基因芯片检测成本过高,筛查例数不够多,今后工作中需进一步扩大样本量,使得筛选的结果更具有代表性。